학습과 기억의 척도 로서의 Drosophila Courtship 컨디셔닝

참고 : 아래에 요약 된 프로토콜에는 수집, 교육 및 테스트의 복제본이 설명되어 있습니다. 결과의 재현성을 테스트하기 위해 이러한 단계를 병렬로, 여러 날에, 그리고 별도의 파리 그룹으로 반복해야합니다 ( 표 1) . 이 프로토콜은 25 ° C, 70 % 습도 및 12 시간의 명암 사이클 조건에서 파리를 키울 때 정상적인 계란에서 성인까지의 10 일 수명주기를 기반으로합니다. 이 프로토콜의 모든 측면은 조건이 전체 분석을 통해 일정하게 유지된다고 가정합니다. 인큐베이터에서 라이트 켜기 (BLO) 또는 라이트 켜기 (ALO)하기 전 시간은 연구원이 선호하는 시간대에 따라 편리하게 설정할 수 있기 때문에 시간으로 표시됩니다. 순진한 수컷 파리의 초기 수집 및 전 암수 수집을 위해서만 CO 2 가스를 사용하십시오. 구혼 컨디셔닝을위한이 프로토콜은 다음 단계로 구성됩니다. 이자형전제 여성 수집 문화 확립 남성 시험 대상자 수집을위한 문화 확립 주택 블록의 준비 표준화 된 전임 암컷의 생산을위한 짝짓기 바이알의 설립 남성 시험 과목 모음 훈련 테스트 비디오 데이터 분석 및 통계 1. 전신 여성 컬렉션 문화 확립 파워 푸드 준비 16 . 8 % (w / v) 효모, 2 % (w / v) 효모 추출물, 2 % (w / v) 펩톤, 3 % (w / v) 자당, 6 % 0.05 % (w / v) MgSO 4 , 및 0.05 % (w / v) CaCl2를 함유하는 용액에 15 분 동안 담지 하였다. 0.05 % (w / v) 메틸 파라벤 (주의 : 독성)과 0.5 % (v / v) 프로피온산 (주의 : 독성)을 첨가하기 전에 용액을 70 ° C로 식힌다. 균질 한 용액을 얻기 위해 50 ℃로 더 냉각하면서 잘 저어 준다. 음식을 먹기 전에실온에서 뚜껑을 덮고, 각 175 mL 플라스틱 바이알에 ~ 50 mL의 파워 푸드를 첨가하십시오. 음식을 더 식히십시오. 바이알을 플러그로 막으십시오. 참고 : Powerfood는 특히 많은 양의 파리를 생산하기 위해 특별하게 제정 된 특수 식품 혼합물로서 아마도 알을 낳는 것을 유도합니다. Powerfood는 비정형식이 요법과 잠재적 인 인구 밀집 현상이 개발에 영향을 줄 수 있기 때문에 행동 분석에 사용되는 수컷 파리를 생산하는 데 사용되지 않습니다 (2 단계). 11 일째 ( 표 1 ) 파워 피드 바이알에 약 60-100 마리의 파리 (남성과 여성의 혼합)가있는 5-20 개의 야생형 배양을 시작하십시오. 이것들은 4 단계에서 표준화 된 전제 암컷을 생산하는데 사용된다. 유충이 번식 할 수있는 영역을 늘리기 위해 각 바이알에 여과지를 추가하십시오. 이것은 eclose 할 수있는 파리의 수를 증가시킬 것입니다. 실험을 통해 1.1-1.3 단계를 주기적으로 반복하여"표준화 된 전임상 암컷의 생산을위한 짝을 이루는 유리 병 설치"(4 단계). 2. 남성 시험 과목 수집을위한 문화 확립 한천, 0.5 % (w / v) 한천, 2.75 % (w / v) 효모, 5.2 % (w / v) 옥수수 가루, 11 % (w / v) 설탕, 0.05 % ) 메틸 파라벤 및 0.5 % (v / v) 프로피온산을 사용하여 수행 하였다. 플라이 바이알 플러그로 175 mL 플라스틱 바이알을 닫으십시오. – 10 일 ( 표 1 ), 정상적인 음식이 들어있는 각 175mL 유리 병에 약 30 ~ 75 명의 처녀 암컷 ( 재료 / 장비 표 )을 10-20 마리 정도 배치하십시오. 파엽의 표면적을 높이고 생산성을 극대화하기 위해 여과지를 추가하십시오. 유전자형 당 3 ~ 6 개의 175 mL 바이알을 수립하여 필요한 피검자 수를 얻으십시오. 참고 : 원하는 병의 생산성에 따라 더 많은 약병이 필요할 수 있습니다.otype. 3. 하우징 블록의 준비 ( 그림 2A ) 전자 레인지에서 하우징 블록 당 약 50 mL의 파워 푸드를 녹이거나 신선한 상태로 준비하십시오. multidispenser 피펫을 사용하여 96 – 웰, 평면 – 바닥 블록의 각 우물에 powerfood의 500 μL를 추가합니다. 음식물을 실온에서 고화 시키십시오. 블록을 PCR 접착 필름으로 덮고 바늘을 사용하여 우물마다 4 개의 구멍을 만들어 파리에 신선한 공기를 공급하십시오. 각 우물을 열 수 있도록 면도날을 사용하여 각 열 사이에서 접착 필름을 세로로 자릅니다. 블록의 한쪽 끝 부분에 필름을 그대로 두십시오. 블록은 최대 2 일 동안 4 ° C에서 보관할 수 있습니다. 참고 : 블록을 사용하기 전에 실온으로 재 평형을 유지하십시오. 4. 표준화 된 조기성 암컷의 생산을위한 짝짓기 약병의 설립 -1 일에2 시간에서 5 시간까지 BLO로 사전 수집 된 여성 컬렉션 문화의 모든 야생형 파리를 폐기하십시오. 2 시간에서 3 시간 간격으로 ( 예 : 30 분, 2.5 시간 및 5 시간에 ALO)이 바이알에서 흡인기 ( 그림 2B )를 사용하여 파리를 수집하고 소량의 효모가 첨가 된 새로운 파워 푸드 바이알에 넣으십시오 붙여 넣기 및 여과지. 혼잡을 피하고 최적의 짝짓기 분위기를 조성하려면 150-200 개 이상의 파리를 각 새 약병으로 옮기지 마십시오. 최소 25 %의 남성을 제공하여 모든 여성의 교미를 보장하십시오. 실험의 크기를 수용하기 위해 짝짓기 바이알에 충분한 암컷이 있는지 확인하십시오. 참고 : 이것은 프로토콜의 중요한 단계이므로 새로 접종 한 파리와 늙은 파리, 유충 또는 번데기는 새로운 짝짓기 바이알로 옮겨지지 않아야합니다. 이 "짝이되는 약병"을 4 일 동안 부화시켜 모든 암컷이 교미 할 수있는 충분한 시간을 허용하십시오. 5. 열남성 시험 과목의 과목 2 ~ 3 시간 BLO 인 1 일 ( 표 1 )에 CO 2 를 사용하여 수컷 수집 바이알에서 성인 파리를 모두 제거하십시오 (2 단계). 그러나 앞으로 몇 시간 동안 더 많은 파리들이 번성하게하십시오. 다음 5-6 시간 동안 CO 2 를 사용하여 매 20-30 분마다 새롭게 처리 된 파리를 제거하고 흡인기 ( 그림 2B )를 사용하여 각 수컷을 하우징 블록 (단계 3)의 개별 우물에 넣으십시오. 접착 PCR 필름으로 웰을 다시 밀봉하십시오. 참고 : 이는 프로토콜에서 중요한 단계입니다. 수컷은 자주 수거해야합니다. 수혈 된 수컷은 반투명 복부에서 창백한 색소 침착과 맹장의 존재를 증명할 때, 기립시기와 가까운 주거 구역에서 격리되어야합니다. 참고 : 흡인기를 부드럽게 사용하면 파리를 옮길 수 있습니다. 그러나, 부적절한 사용은 파리에 스트레스를 줄 것이고, 분석에 차이를 유발할 것이다 (토론 참조). 공동을 목표로유전자형 당 최대 48 마리의 남성을 수색하십시오. 이것은 나이브 및 훈련 된 조건 모두의 분석에 필요한 수컷의 최대 수에 약간의 과잉을 제공하여 이후의 이송 단계에서 약간의 손실을 허용합니다. 6. 훈련 CO 2 를 사용하여 짝짓기 바이알 (단계 4.2)에서 파리를 제거하고 남성에서 전제 암컷을 분리합니다. 흡인기를 사용하여 새 하우징 블록의 한 열에있는 각 우물에 마취 된 단일 여성을 추가하십시오. 흡인기를 사용하고 마취없이, 5.2 절에서 설정된 하우징 블럭에서 개별적인 순진한 수컷을 전치 암컷이 들어있는 우물로 옮긴다. 수컷을 우물에 넣은 후 즉시 접착 필름으로 다시 밀봉하십시오. 수컷이 도망 칠 수 없도록하십시오. 참고 : 자연적인 "부정적인 지구력 (geotaxis)"거동을 이용하여 수면기를 흡입 블럭으로 옮기십시오 (토론 참조). 단계 반복충분한 남성 – 여성 쌍이 성립 될 때까지 6.2-6.3. 이상적으로는, 유전형 당 24 쌍, 하우징 블록의 2 개의 전체 행을 구축하십시오. 남은 순진한 남성은 5.2 단계에서 설정 한 원래 주택 블록에 그대로 두십시오. 훈련 기간 동안 수컷 – 암컷 쌍을 그대로 두십시오 ( 표 2 , 그림 1B ). 참고 :이 시간 동안 남성은 법원에서 전처리 된 여성에 의해 거부됩니다. 학습 및 STM의 경우 교육 기간은 1 시간이며 LTM의 경우 교육 기간은 7-9 ​​시간입니다. 전처리 된 암컷과 수컷을 부드럽게 분리하기 위해 흡인기를 사용하여 훈련을 종료하십시오 ( 표 2 , 그림 1B ). 마취를 사용하지 마십시오. 분리 된 수컷을 새로운 주택 블록에 배치하십시오. 흡입기를 사용하여 모든 순진 남성을 단계 5.2에서 설정된 하우징 블록에서 새 하우징 블록으로 천천히 그리고 마취없이 옮깁니다. 참고 :이 단계는 STM 및 lea의 경우 선택 사항입니다.LTM을 테스트하기 위해 24 시간 동안 비행하기 때문에 LTM은 매우 중요합니다. STM과 LTM의 경우, 시험 전 (단계 7) 수컷이 각각 1 시간과 24 시간 동안 휴식을 취하게하십시오 ( 표 2 , 그림 1B ). 학습을 위해 훈련 받고 순진한 남성을 즉시 테스트하십시오 (7 단계). 7. 테스트 CO 2 를 사용하여 짝짓기 바이알 (단계 4.2)에서 파리를 모으고 수컷과 전 암컷을 분리합니다. 암컷이 정상적인 음식을 담고있는 유리 병에서 적어도 1 시간 동안 마취로부터 회복되도록하십시오. 테스트가 시작되기 전에 모든 장비를 준비하려면 비디오 레코더를 미리 장착하십시오 ( 그림 2C ). 학습, STM 및 LTM ( 표 2 , 그림 1B )에 대한 서로 다른 일정에 따라 테스트를 시작합니다. 훈련 직후에 테스트를 수행하십시오.학습을 위해, STM을위한 훈련 후 1 시간, 그리고 LTM을위한 훈련 후 24 시간. 흡인기를 사용하여 배우자가 닫혀있는 상태에서 배우는 것이 시험되고 있다면 (단계 6.7, 훈련 된, 단계 6.8, 순진) 구획실이 닫힌 상태의 절반에 이르기까지, 휴식중인 주택 블록이나 훈련 하우징 블록에서 개별 남성을 부드럽게 옮기십시오 ( 그림 2D 파일 S1을 참고하십시오). 참고 : 자연스러운 "부정적인 geotaxis"행동의 사용은 남성 파리를 흡인기에서 구애 아레나 (토론)로 옮기는 데 충분해야합니다. 부드럽게 천천히 입문장을 다음 경기장으로 옮기고 모든 18 개의 경기장에 1 명의 수컷이 들어갈 때까지 7.5 단계를 반복하십시오. 흡인기와 CO 2를 사용하지 않고 18 명의 경기장 전부의 나머지 절반에게 사전 준비된 여성 (7.2 단계에서 수집)을 추가합니다. 조심스럽게 우물의 입구가 아래로 향하게하여 구직 챔버를 카메라 아래에 놓습니다 ( 그림 2C </strong>). 수컷과 전제 암컷이 직접 상호 작용할 수 있도록 경기장의 칸막이를 제거하십시오. 적어도 10 분 동안 행동을 기록하기 시작하십시오. 참고 : 두 개의 카메라 설정을 사용하는 경우 효율성을 극대화하기 위해 두 개의 구애 용 판을 동시에 겹쳐서 기록 할 수 있습니다. 핸드 헬드 진공 청소기를 사용하여 구애 경기장을 비우고 재사용하기 전에 구 求실을 환기 시키십시오. 모든 유전형 및 조건 ( 즉, 순진하고 훈련 된)의 시험이 완료 될 때까지 7.4-7.11 단계를 반복하십시오. 8. 비디오 데이터 분석 및 통계 테스트 기간의 처음 10 분 동안 남성 법원이 각 남성 플라이에 대해 시간의 백분율로 정의한 구애 지수 (CI)를 계산합니다. 참고 : 이것은 stereotypical 구애 행동을 관찰하여 수동으로 수행 할 수 있습니다 ( 그림 1A ) 또는구애 행동의 자동 부량을위한 컴퓨터 소프트웨어를 부릅니다 (토론). 참고 : 충분한 통계력을 얻고 CI 데이터의 일관성을 판단하기 위해 3 일 동안 조건 당 40-60 명의 남성을 분석하는 것이 좋습니다. 순진한 남성 (LI = (CI 순진 – CI 연수 ) / 순진 CI 순 )과 비교하여 훈련 된 수컷의 CI 평균 감소율로 정의 된 학습 지수 (LI)를 계산하십시오. 테스트의 각 날에 대해 LI를 평가하고 모든 테스트 일수를 합산 한 누적 LI와 비교하십시오. "Genotype"과 "CI"를 헤더로 사용하여 별도의 2 열 탭 데이터 파일을 만듭니다. 참고 :이 제목은 대 / 소문자를 구분합니다. 각 CI에 대한 유전자형의 이름은 유전자형에 대한 설명 뒤에 밑줄과 훈련 조건 ( 예 : genotype_N 및 genotype_LTM 등, N = naïve 및 LTM = 장기기억; 예를 보충 파일 S2 참조). 이 주석은 필수적입니다. 왜냐하면 analanner는 "Genotype"열의 첫 번째 밑줄 뒤에 나오는 문자를 기반으로 훈련되고 순진한 파리를 식별 할 것이기 때문입니다. analearn R 스크립트 (Supplemental File S3)를 사용하여 다른 유전자형의 LI 값 사이의 차이에 대한 통계적 유의성을 판단하는 무작위 테스트를 수행하십시오. "analearn"이라는 함수를 정의하는 R18에 스크립트 (Supplemental File S3)를 제공하십시오. 참고 : 함수 정의는 다음과 같습니다. analearn <- function (nboot = 10,000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE). R 명령 행에 "analearn ()"을 입력하고 팝업 창을 통해 분석 할 데이터 파일 (8.3 단계에서 생성)을 선택하여 기능을 시작하십시오. 기준 돌연변이를 선택하십시오.해당 숫자를 입력하고 Enter 키를 눌러 컨트롤 유전자형입니다. 참고 : 참조 유전자형을 선택한 후 스크립트는 10,000 부트 스트랩 복제를 수행하는 데 몇 초가 걸립니다. 유전자형, 학습 조건 ( 즉, 학습, STM, 또는 LTM), 평균 CI 평균, 훈련 된 CI, LI, 실험 조건과 비교 한 대조군의 차이를 포함하는 출력 표 (표 3) (LI dif), LI dif의 95 % 신뢰 구간의 하한 (LL) 및 상한 (UL), 및 유의 차가 없을 확률을 나타내는 p 값을 포함한다. 참고 : analearn은 데이터 파일이있는 디렉토리에 출력 텍스트 파일을 저장합니다. 그러나 출력 테이블은 R-Studio 콘솔에도 나타납니다. 기본 이름은 제공된 데이터 파일의 이름에 따라 구성됩니다. analarn 함수에는 de를 변경하는 데 사용할 수있는 몇 가지 인수가 있습니다.기능의 오류 설정은 부트 스트랩의 매개 변수를 조정합니다. 참고 : "nboot"는 부트 스트랩 복제 수를 정의하며 기본적으로 10,000으로 설정됩니다. 이 값은 0보다 큰 정수로 변경할 수 있습니다. 표 5에는 함수의 기본 설정을 변경하는 데 사용할 수있는 몇 가지 인수가 있습니다. 그러나 적은 수의 부트 스트랩 복제로 생성 된 데이터는 사용하지 않는 것이 좋습니다.