Среднесрочная подготовка<em> Drosophila</em> Экстракты эмбрионов для протеомических экспериментов
Summary
Цель этого протокола состоит в том, чтобы обеспечить простой и недорогой подход к сбору эмбрионов дрозофилы в среднем масштабе (0,5-1 г) и приготовлению белковых экстрактов, которые могут быть использованы в протеомических применениях ниже по течению, таких как масс-спектрометрия с аффинной очисткой (AP-MS ).
Abstract
Анализ белково-белковых взаимодействий (ИЦП) стал незаменимым подходом к изучению биологических процессов и механизмов, таких как клеточная сигнализация, развитие организма и заболевание. Часто желательно получить информацию PPI, используя материал in vivo , чтобы получить наиболее естественное и непредвзятое представление о сетях взаимодействия. Плодовая мушка Drosophila melanogaster – отличная платформа для изучения ИЦП in vivo и поддается прямым подходам к изоляции материала для биохимических экспериментов. В частности, эмбрионы плодовой мушки представляют собой удобный тип ткани для изучения ИЦП, из-за легкости сбора животных на этой стадии развития и того факта, что большинство белков выражается в эмбриогенезе, тем самым обеспечивая соответствующую среду для выявления большинства ИЦП. Здесь мы представляем протокол для сбора эмбрионов дрозофилы в среднем масштабе (0,5-1 г), что является идеальным количеством для широкого спектраПротеомических приложений, включая анализ ИЦП методом аффинной очистки-масс-спектрометрии (АР-МС). Мы описываем наши конструкции для клеток 1 L и 5 L для коллекций эмбрионов, которые можно легко и недорого настроить в любой лаборатории. Мы также предоставляем общий протокол для сбора эмбрионов и экстракции белка для получения лизатов, которые могут быть непосредственно использованы в нисходящих приложениях, таких как AP-MS. Наша цель – предоставить доступным средствам для всех исследователей для проведения анализа ИЦП in vivo .
Introduction
Генетические экраны, а в последнее время геномные подходы коренным образом изменили изучение биологических функций. Однако важная клеточная информация кодируется в белках и их ансамбле взаимодействующих партнеров. В то время как традиционные экраны генетических модификаторов могут идентифицировать компоненты, ограничивающие скорость, и восстанавливать косвенные взаимодействия, сила протеомических подходов заключается в их способности идентифицировать полные сети немедленного взаимодействия интересующих белков. Таким образом, Proteomics является ценным ортогональным методом для изучения биологических систем и дополняет геномику, транскриптомику и традиционные генетические экраны. Эффективность аффинной очистки-масс-спектрометрии (AP-MS) оказалась мощным подходом к изучению белково-белковых взаимодействий (ИЦП) в их родной среде в клетках и тканях 1 , 2 . Этот метод позволяет идентифицировать прямые или косвенные взаимодействия при конкретном развитииАльфах или тканевых контекстах, и был успешно использован для идентификации нескольких новых ИЦП в различных вариантах развития (рассмотрен в ссылке 1 ). Несмотря на бесспорный успех исследований ИЦП, большинство из них было проведено в культивируемых клетках, в которых представляющие интерес белки «приманки» были сверхэкспрессированы. Существует два вопроса с изучением ИЦП в культуре клеток: во-первых, конкретная клеточная линия не может обеспечить полный набор взаимодействий из-за отсутствия экспрессии определенных белков. Во-вторых, высокая избыточная экспрессия, обычно используемая в таких анализах, может приводить к возникновению артефактов, таких как неправильное распределение белка или идентификация ложноположительных взаимодействий.
Оба этих ограничения можно преодолеть, проанализировав ИЦП in vivo . Ограничивающим этапом в таких экспериментах является доступность исходного материала для очистки белковых комплексов. Drosophila melanogaster уже давно используется в качестве модели для функционального анализаSis, и в последнее время также была продемонстрирована отличная система для изучения ИЦП in vivo . Эмбриогенез дрозофилы представляет собой особенно привлекательный тип ткани для изучения ИЦП, поскольку эмбрионы можно легко собирать в больших количествах, а также потому, что большинство генов (> 88%) экспрессируются в течение эмбриогенеза, тем самым обеспечивая богатую среду in vivo для выявления соответствующих ИЦП 3 .
Традиционно в биохимических исследованиях у мух использовались очень крупномасштабные коллекции эмбрионов (100-150 г), такие как необходимые для очистки функциональных транскрипционных лизатов 4 , 5 . Предыдущие исследования AP-MS у Drosophila также нуждались в большом количестве эмбрионов (5-10 г), поскольку они полагались на двухступенчатый подход к очистке, такой как тандемная аффинная очистка (TAP), с соответствующей потерей материала на каждой стадии 6 . Большой amounTs исходного материала потребовало создания коллекций эмбрионов в больших популяционных клетках, которые могут быть как дорогостоящими (при покупке на коммерческой основе), так и трудоемкими для поддержания и очистки 7 , 8 , 9 .
Недавние достижения в разработке одностадийных аффинно-очистных подходов, а также возрастающая чувствительность масс-спектрометров на порядок уменьшили необходимое количество исходного материала. Используя теги, такие как стрептавидинсвязывающий пептид (SBP) или зеленый флуоресцентный белок (GFP) и начиная с менее 1 г эмбрионов, можно выделить количества белка приманки и взаимодействующих компонентов, которые были бы достаточны для идентификации посредством Масс-спектрометрия 10 , 11 .
Цель представленного здесь протокола – помочь исследователям overcoЯ воспринимаю барьер для биохимического анализа ИЦП in vivo . С этой целью мы предлагаем простую и недорогую процедуру для сбора эмбрионов дрозофилы в среднем масштабе (0,5-1 г) с последующим одностадийным приготовлением цельноклеточных белковых экстрактов, которые пригодны для последующего анализа с помощью AP-MS или других подходов , Наш метод основан на использовании специально изготовленных 1-L или 5-L популяционных клеток, которые могут быть легко получены любой лабораторией. Кроме того, условия экстракции, представленные здесь, были подтверждены в нескольких исследованиях как в культивируемых клетках, так и in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, представленный здесь, представляет собой простую и общую процедуру для создания популяционных клеток дрозофилы в среднем масштабе и получения экстрактов белков цельной клетки из эмбрионов. Полученные экстракты могут быть использованы во множестве последующих пр?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят членов лаборатории Veraksa за полезные комментарии к рукописи и предложения по совершенствованию протокола. AV был поддержан грантами NIH GM105813 и NS096402. LY был поддержан Университетом штата Массачусетс Бостон Sanofi Genzyme Докторантура.
Materials
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | For making 5-L cages. |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation. |
| Sefar NITEX nylon mesh | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open area, used for fly cages. |
| Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch cutting tool for making 1-L cages. |
| Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure | Fisher Scientific | 11-823-33 | For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used. |
| Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch | Red Star | can be purchased from Amazon.com or other suppliers. | |
| Frozen 100% Apple Juice Concentrate | can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can. | ||
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Acros Organics | AC126965000 | also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates. |
| IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml | Sigma | I8896 | used for preparing lysis buffer. |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer. |
| Corning SFCA syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples. |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher Scientific | 14-823-2A | for filtering final extract samples. BD cat # 309604. |
| Bleach | Clorox | used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well. |
| Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544. |
Riferimenti
- Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
- Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).
- Arbeitman, M. N., et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).
- Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).
- Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos. Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system. Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. J Vis Exp. (109), (2016).
- Yang, L., et al. Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).
- Neumuller, R. A., et al. Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes. Genetica. 190 (3), 931-940 (2012).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).
- Mukherjee, A., et al. Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin. Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).
- Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie. Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).
- Anjum, S. G., et al. Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1. Genetica. 195 (4), 1307-1317 (2013).
- Degoutin, J. L., et al. Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous. Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).
- Zhang, C., et al. The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue. Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Vincent, J. P., Girdham, C. H., O’Farrell, P. H. A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics. Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).
- Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos. J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).
- Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development. Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).
- Ramirez, J., et al. Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells. PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).
