Mittelmaßnahme Vorbereitung von<em> Drosophila</em> Embryoextrakte für Proteomversuche
Summary
Ziel dieses Protokolls ist es, einen direkten und kostengünstigen Ansatz für die Sammlung von Drosophila- Embryonen im mittleren Maßstab (0,5-1 g) und die Herstellung von Proteinextrakten, die in nachgeschalteten proteomischen Anwendungen verwendet werden können, wie Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS ).
Abstract
Die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) ist zu einem unverzichtbaren Ansatz geworden, um biologische Prozesse und Mechanismen wie Zell-Signalisierung, Organismusentwicklung und Krankheit zu untersuchen. Es ist oft wünschenswert, PPI-Informationen unter Verwendung von in vivo- Material zu erhalten, um die natürlichste und unvoreingenommenste Sicht auf die Interaktionsnetze zu gewinnen. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist eine hervorragende Plattform, um PPIs in vivo zu studieren, und eignet sich für einfache Ansätze zur Isolierung von Material für biochemische Experimente. Insbesondere stellen Fruchtfliege-Embryos eine bequeme Art von Gewebe dar, um PPIs zu untersuchen, aufgrund der Leichtigkeit des Sammelns von Tieren in diesem Entwicklungsstadium und der Tatsache, dass die Mehrheit der Proteine in der Embryogenese exprimiert wird, wodurch eine relevante Umgebung bereitgestellt wird, um die meisten PPIs zu enthüllen. Hier stellen wir ein Protokoll für die Sammlung von Drosophila- Embryonen im mittleren Maßstab (0,5-1 g) vor, was eine ideale Menge für eine breite Palette vonProteomische Anwendungen, einschließlich der Analyse von PPIs durch Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS). Wir beschreiben unsere Entwürfe für 1 L und 5 L Käfige für Embryosammlungen, die in jedem Labor leicht und kostengünstig eingerichtet werden können. Wir bieten auch ein allgemeines Protokoll für Embryo-Sammlung und Proteinextraktion, um Lysate zu erzeugen, die direkt in nachgeschalteten Anwendungen wie AP-MS verwendet werden können. Unser Ziel ist es, allen Forschern ein zugängliches Mittel zu bieten, um die Analysen von PPIs in vivo durchzuführen.
Introduction
Genetische Bildschirme und in jüngster Zeit haben genomische Ansätze das Studium der biologischen Funktionen revolutioniert. Wichtige zelluläre Informationen sind jedoch in Proteinen und ihrem Ensemble von interagierenden Partnern codiert. Während traditionelle genetische Modifikatorbildschirme ratenbegrenzende Wegkomponenten identifizieren und indirekte Wechselwirkungen wiederherstellen können, liegt die Stärke der proteomischen Ansätze in ihrer Fähigkeit, vollständige unmittelbare Interaktionsnetze von interessanten Proteinen zu identifizieren. Proteomik ist also eine wertvolle orthogonale Methode, um biologische Systeme zu studieren und ergänzt Genomik, Transkriptomik und traditionelle genetische Bildschirme. Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS) hat sich als ein leistungsfähiger Ansatz zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) in ihrer nativen Umgebung in Zellen und Geweben 1 , 2 erwiesen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von direkten oder indirekten Wechselwirkungen bei einer spezifischen EntwicklungAl-Stadien oder Gewebe-Kontexte, und wurde erfolgreich verwendet, um mehrere neuartige PPIs in einer Vielzahl von Entwicklungswegen zu identifizieren (siehe Referenz 1 ). Trotz des unbestrittenen Erfolgs von PPI-Studien wurden die meisten von ihnen in kultivierten Zellen durchgeführt, in denen die interessierenden "Köder" -Proteine überexprimiert wurden. Es gibt zwei Probleme mit dem Studium von PPIs in der Zellkultur: Erstens kann eine spezifische Zelllinie keine vollständige Komplementierung von Wechselwirkungen aufgrund des Mangels an Expression bestimmter Proteine liefern. Zweitens könnte eine hohe Überexpression, die gewöhnlich bei solchen Analysen verwendet wird, zu Artefakten führen, wie z. B. Proteinfehlfalten oder Identifizierung von falsch positiven Wechselwirkungen.
Beide Einschränkungen können durch die Analyse von PPIs in vivo überwunden werden . Ein limitierender Schritt bei solchen Experimenten ist die Verfügbarkeit des Ausgangsmaterials zur Reinigung von Proteinkomplexen. Drosophila melanogaster ist seit langem als Modell für funktionelle Analyten verwendet wordenSis, und vor kurzem wurde auch gezeigt, dass es ein ausgezeichnetes System für das Studium von PPIs in vivo ist . Die Drosophila- Embryogenese stellt einen besonders attraktiven Gewebetyp dar, um PPIs zu untersuchen, da Embryonen leicht in großen Mengen gesammelt werden können und auch weil die meisten Gene (> 88%) im Verlauf der Embryogenese exprimiert werden, so dass eine reiche in vivo- Umgebung für die Erkennung von relevanten Informationen bereitgestellt wird PPIs 3
Traditionell verwendeten biochemische Studien an Fliegen sehr große Embryosammlungen (100-150 g), wie sie für die Reinigung von funktionellen Transkriptionslysaten 4 , 5 notwendig sind . Bisherige AP-MS-Studien in Drosophila benötigten auch große Mengen an Embryonen (5-10 g), da sie sich auf einen zweistufigen Reinigungsansatz wie Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) mit dem damit verbundenen Materialverlust bei jedem Schritt 6 stützten. Großes amounTs des Ausgangsmaterials erforderten die Einrichtung von Embryosammlungen in großen Populationskäfigen, die sowohl teuer sein können (wenn sie kommerziell gekauft werden) und zeitaufwändig, um 7 , 8 , 9 zu erhalten und zu reinigen.
Jüngste Fortschritte bei der Entwicklung von Einstufen-Affinitätsreinigungsansätzen sowie die zunehmende Empfindlichkeit von Massenspektrometern haben die notwendige Menge an Ausgangsmaterial um eine Größenordnung reduziert. Unter Verwendung von Markierungen wie dem Streptavidin-bindenden Peptid (SBP) oder dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) und ausgehend von weniger als 1 g Embryos ist es möglich, die Mengen des Köderproteins und die interagierenden Komponenten zu isolieren, die für die Identifizierung durch ausreichend sind Massenspektrometrie 10 , 11 .
Das Ziel des hier vorgestellten Protokolls ist es, den Forschern Overco zu helfenMir eine wahrgenommene Barriere zur biochemischen Analyse von PPIs in vivo . Zu diesem Zweck stellen wir ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Verfügung, um Drosophila- Embryos im mittleren Maßstab (0,5-1 g) zu sammeln, gefolgt von einer einstufigen Herstellung von ganzzelligen Proteinextrakten, die für die anschließende Analyse durch AP-MS oder andere Ansätze geeignet sind . Unsere Methode beruht auf der Verwendung von maßgeschneiderten 1-L- oder 5-L-Populationskäfigen, die von jedem Labor leicht hergestellt werden können. Weiterhin wurden die hier vorgestellten Extraktionsbedingungen in mehreren Studien sowohl in kultivierten Zellen als auch in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 validiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier vorgestellte Protokoll ist ein einfaches und allgemeines Verfahren für die Einrichtung von Drosophila- Populationskäfigen im mittleren Maßstab und die Herstellung von ganzzelligen Proteinextrakten aus Embryonen. Die resultierenden Extrakte können in einer Vielzahl von nachgeschalteten Anwendungen verwendet werden, wie die Reinigung von Proteinkomplexen auf Affinitätsharze. Es ist entscheidend, die Extraktionsschritte auf Eis durchzuführen und eine starke Proteasehemmung…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den Mitgliedern des Veraksa-Labors für hilfreiche Kommentare zum Manuskript und Vorschläge für Protokollverbesserungen. AV wurde von den NIH-Stipendien GM105813 und NS096402 unterstützt. LY wurde von der University of Massachusetts Boston Sanofi Genzyme Doctoral Fellowship unterstützt.
Materials
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | For making 5-L cages. |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation. |
| Sefar NITEX nylon mesh | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open area, used for fly cages. |
| Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch cutting tool for making 1-L cages. |
| Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure | Fisher Scientific | 11-823-33 | For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used. |
| Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch | Red Star | can be purchased from Amazon.com or other suppliers. | |
| Frozen 100% Apple Juice Concentrate | can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can. | ||
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Acros Organics | AC126965000 | also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates. |
| IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml | Sigma | I8896 | used for preparing lysis buffer. |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer. |
| Corning SFCA syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples. |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher Scientific | 14-823-2A | for filtering final extract samples. BD cat # 309604. |
| Bleach | Clorox | used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well. |
| Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544. |
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