Estudio de la expresión genética regulada por el ciclo celular mediante dos protocolos complementarios de sincronización celular

La transición a través de todas las fases del ciclo celular se acopla a un programa de expresión génica fuertemente regulado. Se supone que esta coordinación "en y fuera" de la transcripción de genes a lo largo del ciclo celular está bajo el control de sistemas reguladores transcripcionales complejos, regulando no sólo el momento sino también los niveles de expresión génica. Se sabe que la desregulación de los componentes clave del ciclo celular contribuye al desarrollo de varias enfermedades y es un sello bien establecido de la tumorigénesis ^{1 , 2} . Los análisis transcriptómicos de todo el genoma llevados a cabo en células de levadura y de mamífero han revelado que un gran número de genes exhiben patrones de expresión génica periódicos en el ciclo celular, lo que sugiere que la fluctuación transcripcional durante el ciclo celular es un reflejo del requisito temporal de un producto génico dado En una fase precisa ^{3 , 4 ,} </suP> ⁵ .

Una tarea importante en el estudio de la expresión de genes regulados por el ciclo celular es la sincronización de células en fases específicas del ciclo celular. La sincronización celular ayuda a interpretar la asociación de un patrón de expresión génica a una transición de fase particular del ciclo celular, y ha conducido a una mejor comprensión de la regulación y la función de numerosos genes. La sincronización celular también es importante para el estudio del mecanismo de acción de los fármacos contra el cáncer, ya que los agentes quimioterapéuticos se sabe que afectan tanto la expresión de genes, así como la cinética del ciclo celular [ ^{6 , 7]} . Sin embargo, a menudo es difícil determinar si las diferencias de expresión génica resultantes del tratamiento con estos agentes son una respuesta directa al tratamiento o son meramente la consecuencia de cambios en los perfiles del ciclo celular. Para distinguir entre estas posibilidades, la expresión génica debe analizarse en células que han sido sYnchronized antes de la adición del fármaco quimioterapéutico.

Con la excepción de algunas células primarias tales como células linfoides recién aisladas -que constituyen una población celular homogénea sincronizada en G08-, las líneas celulares establecidas in vitro crecen asincrónicamente en cultivo. Bajo condiciones de crecimiento regular, estas células de ciclo asincrónico se encuentran en todas las fases del ciclo celular, pero, preferentemente en G1 ⁹ . Por lo tanto, este contexto no proporciona un escenario óptimo para el análisis funcional o de expresión génica en una fase específica del ciclo celular ( por ejemplo , G1, S, etc.). Las líneas celulares inmortalizadas no transformadas ( por ejemplo, fibroblastos) pueden sincronizarse con los llamados métodos fisiológicos ¹⁰ . Estos métodos se basan en las características de células primarias retenidas de las células no transformadas, tales como la inhibición del contacto celular y la dependencia del factor de crecimiento con el fin de continuar el ciclo. EliminaciónDe suero en combinación con inhibición de contacto hace que las células no transformadas sean detenidas en G0 / G1. Sin embargo, la sincronización del ciclo celular de entrada y la progresión a menudo requiere de subcultura, que también implica el desprendimiento artificial de las células y re-chapado [ ^10] . Más importante aún, este método no es adecuado para la sincronización de líneas celulares transformadas, la gran mayoría de líneas celulares establecidas actualmente en uso, caracterizado por carecer de inhibición del crecimiento mediada por contacto celular o respuesta a la retirada del factor de crecimiento. Por lo tanto, es evidente que se requieren métodos alternativos para la sincronización celular eficiente en fases específicas del ciclo celular. En términos generales, los métodos de sincronización más utilizados se basan en la inhibición química o farmacológica transitoria de un punto definido del ciclo celular, típicamente síntesis de ADN o formación de huso mitótico. La inhibición de la síntesis de ADN sincroniza las células deteniéndolas en fase G1 tardía o temprana. Esto puede hacerse¹² , aphidicolin, un inhibidor de ADN polimerasas ^{13 , 14} , hidroxiurea, un inhibidor de ribonucleotide reductasa ^{15 , 16} o por cantidades en exceso de timidina ^{17 , 18} . Por otra parte, los inhibidores de la polimerización de los microtúbulos, tales como la colchicina o el nocodazol, son capaces de bloquear la formación del huso mitótico que conduce a la sincronización celular a principios de la fase M ^{19 , 20 , 21} .

En este trabajo se describe un método que implica dos protocolos de sincronización complementarios basados ​​en la inhibición química transitoria para el estudio de la expresión de los genes regulados por el ciclo celular en el mRNAnivel. Este método es fundamental para definir el papel de los genes del ciclo celular en procesos específicos del ciclo celular. Además, proporciona un marco general para estudiar el impacto de los tratamientos contra el cáncer con el fin de detectar con precisión genes fármacos sensibles y para minimizar las interpretaciones erróneas derivadas de las perturbaciones en la progresión del ciclo celular generado por estos fármacos.