인간 독성 Pluripotent 줄기 세포의 신경 독성 테스트를위한 뉴런과 Glia의 혼합 문화로의 분화를위한 프로토콜

1. 인간 유도 된 다 능성 줄기 세포 (hiPSC) 확장 참고 : hiPSCs는 mTeSR1 5x 보충제 (제조사의 지침에 따라 준비, 플레이트 ~ 100 식민지 조각 / 60mm 페트리 접시)가 포함 된 mTeSR1 매체의 존재하에 적절한 단백질 혼합 기판에서 배양 할 수 있습니다. hiPSC 콜로니가 적절한 크기에 도달하면 ( 그림 2A 의 식민지 예 참조), 아래에 설명 된대로 (일주일에 한 번) 세포를 통과시킵니다. hESC 인증 된 기저막 매트릭스 (이하 "적격 매트릭스") 또는 기타 적합한 단백질 기질이 들어있는 코트 요리. 차가운 1.5 ML 튜브와 차가운 5 또는 10 ML pipettes에 200 μL aliquots에서 -80 ° C에서 자격 매트릭스 (재료의 테이블을 참조 ) 저장하십시오. 계대 배양하기 전에 얼음에 적정 매트릭스 200 μL를 녹입니다. 20 m에서 적정 매트릭스 200 μL 희석L의 DMEM / F12 배지 (1 : 100 희석). 이 용액 (5 mL / dish)으로 60 mm 페트리 접시를 코팅하십시오. 적어도 1 시간 37 ° C에서 코팅 접시를 품어. HiPSC 식민지 조각 냉동 및 해동 hiPSC 식민지를 절단 후 (hiPSC 식민지 절단 절차에 대해 단계 1.3 참조), 줄기 세포 동결 매체, ~ 100 조각 / 250 μL (재료 표 참조)에 hiPSC 식민지 조각을 부드럽게 천천히 다시 부순다. 분주 보존 (250 μL / 유리 병)에 적합한 유리 병에서 식민지 파편. 바이알을 2- 프로판올로 채워진 용기에 넣고 최소 2 시간 및 최대 2 주 동안 용기를 -80 ° C에 놓습니다. 바이알을 액체 질소 탱크의 기상으로 옮긴다. 배양을 다시 시작하려면 37 ° C의 수 욕조에서 1 개의 고정 바이알을 녹입니다. 부드럽게 pre-warmed 완전한 hiPSC의 7 ML에 hiPSC 식민지 조각을 수집1 mL, 2 mL 또는 5 mL 피펫을 사용하여 15 mL 튜브 에 넣습니다 (재료 표 참조). 3 분 동안 130 XG에서 hiPSC 식민지 조각을 원심 분리기. 뜨는을 제거하고 부드럽게 1, 2, 또는 5 ML 피펫을 사용하여 완전한 hiPSC 매체의 1 ML에 hiPSC 식민지 조각을 resuspend. 3 또는 4 mL의 완전한 hiPSC 배지에서 세포 현탁액을 추가 희석한다. 자격이 매트릭스 코팅 60mm 페트리 접시 (~ 100 조각 / 접시에 hiPSC의 식민지 조각을 접시, 단계 1.1에서 설명한대로 요리 코트). hiPSCs를 37 ° C 및 5 % CO 2 에서 배양하십시오. 매일 매체 전체를 변경하십시오. hiPSC 콜로니의 계대 배양 참고 : 미분화 된 hiPSCs는 큰 nucleoli과 풍부한 세포질없이 둥근 모양이어야합니다. 미분화 된 콜로니는 평평하고 단단히 채워진 형태로 특징 지어 져야한다. 오직 미분화 된 콜로니 (약 1mm in 직경)은 더 이상의 passaging을 위해 절단되어야한다. 줄기 세포 식민지를 약 200 μm x 200 μm의 사각형으로 30G 바늘 또는 다른 상업적으로 이용 가능한 도구가있는 1 mL 주사기를 사용하여 잘라냅니다 (재료 표 참조). 상온에서 층류 캐비닛의 배율 4 배의 입체 현미경을 사용하십시오. 조각을 들어 올리려면 아래에 매체를 부드럽게 pipetting하여 200 – μL 피펫을 사용하여 접시 표면에서 식민지 조각을 분리합니다. 식민지 조각 (~ 100 조각)을 완전한 HiPSC 배지 4 ML (표 1.1 참조)로 채워진 자격 매트릭스 -DMEM / F12 코팅 플레이트에 옮기십시오 (1.1 절에서 설명한대로 접시를 칠하십시오). 37 ° C와 5 % CO 2 에서 새 플레이트를 품어. 매일 매체 전체를 변경하고 4X 및 10X 배율의 위상 – 대조 현미경을 사용하여 콜로니의 형태를 검사합니다. 2. HiPSC Differe혼합 뉴런과 글 리아로의 통합 참고 : 절차는 그림 1 (상단)에 요약 된 주요 단계를 완료하는 데 약 28 일이 소요됩니다. 그림 1 : 연결의 분화 프로토콜의 도식 표현. (상단 부분) IMR90-hiPSC 콜로니는 조각으로 절단되어 배아 체 (EB)를 형성 할 수 있습니다. 시험관 내 (DIV) 에서 2 일 후, EBs는 laminin 또는 표준 매트릭스 코팅 요리에 도금 수 neurepectial 유도 (NRI) 매체의 존재에서 neuroectodermal 유도체 (rosettes, 여기에 nestin (녹색) 및 β -III- 튜 불린 (적색)). 로제트는 분리되거나 수집되어 라미네이트 또는 표준 매트릭스 코팅 접시에 재현 될 수 있으며 성숙한 신경 세포 (NF200, 적색) 및 신경아 교세포(GFAP, 녹색) 뉴런 분화 (ND) 매체의 면전에서 세포. (Nestin, red)은 신경 유도 (Neural induction, NI) 배지의 존재하에 확장되거나, 동결 보존되거나, 또는 ND 배지의 존재 하에서 추가로 분화되어 혼합 된 신경 세포 (NF200, 녹색) 및 신경교 (glial)를 형성 할 수있다 GFAP, red) 문화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 배아 체 (EB) 생성 (0 일 → 1 일) 참고 :이 절차를 수행하려면 올바른 수동 기술과 정밀도가 필요합니다. HiPSC 식민지 조각은 다음 단계에서 균일 한 배아 체 (EB)를 얻기 위해 동일한 크기 여야합니다. Morphologically 분화 식민지 (큰 세포질 분수와 작은 nucleoli) 폐기해야합니다. undifferentiated hiPSC 식민지 (diam에서 약 1mm)를 절단하기 전에 hiPSC 매체 (3 ML / 60 – mm 페트리 접시)를 새로 고침eter, 도 2A 참조 )를 사용하여 배양 하였다 (단계 1에서 기술 된 바와 같다). 30G 바늘과 1 ML 주사기를 사용하여 약 200 μm의 X 200 μm의 조각으로 undifferentiated 식민지를 잘라내십시오 ( 그림 2A 및 그림 2B 와 같이 ). 상온에서 층류 캐비닛의 배율 4 배의 입체 현미경을 사용하십시오. 조각을 들어 올리려면 아래에 매체를 부드럽게 pipetting하여 200 – μL 피펫을 사용하여 접시 표면에서 식민지 조각을 분리합니다. 1, 2 또는 5 mL 피펫을 사용하여 분리 된 모든 단편과 배지를 15 mL 튜브에 옮긴다. 모든 조각을 복구하는 완전한 HiPSC 매체 2 ML로 접시를 씻어. 1 분 112 XG에서 원심 분리기. 뜨는을 대기음하고 부드럽게 완전한 hiPSC EB 매체 5 ML (재료의 테이블을 참조 ) 에 조각을 resuspend . 공동 판60 mm 초저 애착 배양 접시 (5 mL / 60 mm 배양 접시)에 lony 파편을 넣습니다. 37 ° C와 5 % CO 2 에서 밤새 배양 접시를 품어. 다음 날 (1 일)에 1, 2 또는 5 mL 피펫을 사용하여 15 mL 튜브에 EB 및 그 배지를 수집합니다. 1 분 동안 112xg에서 EB를 원심 분리하십시오. 조심스럽게 뜨는을 기음과 부드럽게 1, 2, 또는 5 ML 피펫을 사용하여 완전한 hiPSC EB 매체의 5 ML에 EBs를 resuspend. 새 60mm 초저 부착 페트리 접시 (5mL / 60mm 페트리 접시)에 EB를 보급하십시오. 37 ° C와 5 % CO 2 에서 밤새 배양 접시를 품어. 1 일째, 기저막 매트릭스 ( 예 : matrigel, 이하 "표준 매트릭스"라고 함) 또는 기타 적합한 단백질 기질 ( 예 : 라미닌)으로 접시를 코팅하십시오. -80 ° C에서 표준 매트릭스를 보관하십시오 ( 재료 표 참조).차가운 1.5 mL 튜브 및 차가운 5 또는 10 mL 피펫을 사용하여 200 μL 분액. 얼음 위에서 표준 매트릭스 200 μL를 녹입니다. 20 ML의 DMEM / F12 배지 (1 : 100 희석)에 표준 매트릭스 200 μL를 희석. 이 용액 (5 mL / dish)으로 60 mm 페트리 접시를 코팅하십시오. 37 ° C에서 코팅 접시를 품어. 참고 :이 접시는 EBs (약 50 EBs / dish)을 판과 neuroepithelial 집계 (rosettes)를 생성하는 데 사용됩니다; 2.3 단계를 참조하십시오. neuroepithelial aggregates (rosettes)의 생성 (2 일 → 7 일) 2 일째, 60-mm 배양 접시에서 표준 매트릭스 코팅 용액을 제거하고 (플레이트를 헹굴 필요가 없음) 완전한 신경 상피 유도 배지 (NRI) 5 mL / dish로 채 웁니다. 재료 표를 참조하십시오. 입체 음하에 200 μL 피펫을 사용하여 부동 EB (단계 2.1.14에서)을 코팅 접시 (~ 50 EB / dish)로 옮긴다.4 배 배율의 croscope로 층류 캐비닛에 놓습니다. 참고 : 균일 한 중간 크기의 EB (~ 200-300 μm 직경)을 선택하는 것이 중요합니다. 너무 작은 EB는 신경 외배엽 분화 동안 잘 살아남지 못하는 반면, 너무 큰 EB는 중추 괴사를 겪는 경향이있다. 37 ° C와 5 % CO 2 에서 접시를 품어. 다음날 (3 일)에 EB가 모두 부착되었는지 확인하기 위해 현미경으로 접시를 10 배 확대하여 검사합니다. 완전한 NRI 매체를 사용하여 부드럽게 전체 매체 변화를 수행하십시오. neurepithelial aggregates (rosettes)가 보여야하는 날 7까지 ​​매일 NRI 배지를 교체하십시오. 7 일째, 2.2 단계에서 설명한대로 표준 플레이트 (또는 라미닌)를 96- 플레이트 (100 μL / 웰), 24- 웰 플레이트 (250 μL / 웰), 12- 웰 플레이트 (500μL / 웰), MEA 칩 (전기 활성을위한, 1mL / 단일 웰 칩), 또는 60mm 페트리 디쉬s (4 mL / dish). 37 ° C와 5 % CO 2 에서 최소 2 시간 동안 코팅 된 접시 / 접시를 품어 라. 로제트 해리 및 신경 세포 분화 (8 일 → 28 일) 참고 :이 절차를 수행하려면 올바른 수동 기술과 정밀도가 필요합니다. 중배엽 및 내배엽 세포의 수집을 피하기 위해, 외배엽 로제 같은 조직 만 해리하고 수집해야합니다. 8 일째, 멸균 상태에서 배율 10 배의 입체 현미경으로 장미 모양의 구조물을 조각으로 자른다. 30G 바늘과 1 ML 주사기를 사용하십시오. 장미는 바늘로 만졌을 때 접시에서 쉽게 분리되는 경향이 있습니다. 200 μL 피펫을 사용하여 로제트 파편의 분리를 완료하십시오. 층류 후드 아래 접시를 전송하고 1, 2, 또는 5 ML 피펫을 사용하여 15 ML 원추형 튜브에 로제트 조각과 그들의 매체를 수집합니다. 접시를 NRI 매체 2 ML로 씻어 복구모든 조각. 2 분 동안 112xg로 로제트 조각을 스핀 다운하십시오. 뜨는을 대기음. 부드럽게 1x DPBS (칼슘과 마그네슘없이) 1 ML에 펠렛을 부드럽게 resuspend하고 부드럽게 그들을 분열시키기 위해 1,000 – μL 피펫을 사용하여 로제트 파편을 위아래로 피펫. 완전한 NRI 매체 4 ML을 추가하고 세포를 트리 판 블루와 자동 셀 카운터를 사용하여 계산합니다 ( 재료 표 참조) 참고 : Trypan 블루 20 μL에 세포 현탁액 20 μL를 희석. 세포가 단일 세포 현탁액으로 될 수없는 경우이 단계는 생략 될 수있다. 로제트 조각이 완전히 해부되지 않은 것처럼 보이면 약 50 EB / 60 mm 접시에서 추출한 로제트 조각을 표 1 에 표시된대로 50 mL의 완전한 NRI 배지에 재용 해하고 도금 할 수 있습니다. 배양 접시, 플레이트 및 / 또는 MEA 칩 (2.3 단계.)에서 표준 매트릭스 (또는 라미닌) 코팅 솔루션을 기음.7). 그들이 말리 지 않도록하십시오. 연구 계획 (약 15,000 세포 / cm 2 , 도금 볼륨 표시에 대한 표 1 참조)에 따라 완전한 NRI 매체에 세포를 플레이트하십시오. 37 ° C 및 5 % CO 2 에서 하룻밤 동안 플레이트를 품어. 10 일째, 완전한 신경 분화 매체 (ND)를 사용하여 전체 매체 변화를 수행; 재료 표를 참조하십시오. 일주일에 두 번 Day 28까지 ND 미디어를 새로 고칩니다. 5 단계 (일반적인 수용 기준에 대해서는 표 2 참조)에 설명 된대로 신경 세포 / 신경교 세포 유도체를 특성화합니다. 3. HiPSC 유래 신경 줄기 세포 (NSC) 혼합 뉴런과 Glia 로의 분화 참고 : 로제트 조각에서 추출한 NSC는 아래에 설명 된 절차 ( 그림 1 , 하단 부분)에 따라 확장 및 유지 관리 할 수 ​​있습니다. 이렇게하면 th를 증가시킬 수 있습니다.분화 및 화학 시험을위한 세포 수. 표준 매트릭스 DMEM / F12 코팅 솔루션의 5 ML와 60mm 페트리 접시 (또는 T – 25 플라스크)를 코팅하고 ( 2 단계에서 설명한대로) 37 ° C와 5 % CO 2 에서 적어도 2 시간 품어. 원뿔형 15 ML 튜브에서 112xg로 2 분 (단계 2.4 참조)에서 추출한 로제트 조각을 스핀 다운하십시오. 부드럽게 신경 유도 매체 (NI)의 5 ML에 펠렛을 resuspend; 재료 표를 참조하십시오. 표준 매트릭스 코팅 60mm 배양 접시 (또는 T – 25 플라스크)에 세포를 전송합니다. 세포 배양액이 합류점에 도달 할 때까지 매일 매체를 새로 고침하여 NI 배지의 존재하에 로제트 유래 NSC를 배양합니다. 합류 할 때, 다음 단계에서 기술 된대로 NSC를 통과시킨다. 참고 : NSC를 일주일에 한 번 통과하십시오. 연구 계획에 따라 갓 코팅 한 접시, 플라스크 또는 접시 사용을 고려하십시오. 완전한 NI 매체와 gentl 제거NBS를 DPBS (칼슘과 마그네슘없이)로 씻어 낸다. 세포가 들어있는 60 – mm 페트리 접시 (또는 T – 25 플라스크) 37 ° C 미리 예열 0.05 % 트립신 – EDTA 1.5 ML을 추가하고 1 분 인큐베이터에 놓으십시오. 부드럽게 세포 (또는 플라스크)를 탭 세포를 분리합니다. 37 ° C로 예열 된 트립신 저해제 1.5 mL를 넣고 세포를 15 mL 튜브에 옮긴다. 페트리 접시 (또는 T – 25 플라스크)를 NI 매체 (1.5 ML)의 동일한 볼륨으로 씻어 동일한 15 ML 튜브에 볼륨을 수집합니다. 3 분 130 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 제거하고 천천히 μl 피펫을 사용하여 완전한 NI 매체 1 ML에있는 세포를 resuspend. 추가로 3 또는 4 ML 완전한 NI 매체의 세포 현탁액을 희석하고 세포를 트리 판 블루와 자동 셀 카운터를 사용하여 계산합니다. 단계 3.1에서 NSCs를 약 50,000 세포 / cm 2 의 밀도로 60mm 페트리 접시 (또는 T – 25 플라스크)에 놓으십시오. <li> 매일 NI 완전한 매체로 전체 매체 변경을 수행하십시오. 5 단계에서 설명한대로의 연결 / glial 세포 유도체의 존재에 대한 세포를 특성화합니다. 참고 : NSCs는 완전한 ND 매체 (단계 2.4.11-2.4.13에서 설명)에서 뉴런과 glia의 혼합 문화로 구분할 수 있으며, 완전한 ND 매체를 일주일에 두 번 21 일 동안 새로 고칠 수 있습니다. 4. HiPSC 유래 NSC 저온 보존 및 해동 참고 : passaging, NSCs는 동결 수 있으며이 절차를 다시 해동. 130xg에서 3 분 동안 계대 배양 한 NSCs (단계 3.12)를 원심 분리한다. 참고 : 셀은 3.14 단계에서 계산해야합니다. 천천히 부드럽게 천천히 NSCs 3 X 10 6 / ML 얼어 매체 ( 테이블의 자료를 참조) 에 resuspend . cryopreservation (약 0.5 ML = 1.5 X 10 6 / 유리 병)에 적합한 유리 병에 세포를 나누어주십시오. 바이알을 용기에 넣는다.2- 프로판올로 채운 다음 최소 2 시간 및 최대 2 주간 -80 ° C에 용기를 놓습니다. 바이알을 액체 질소 탱크의 증기 상으로 옮긴다. 세포 배양을 다시 시작하려면 37 ℃의 수조에서 1 개의 고정 바이알을 녹입니다. 부드럽게 1,000 μL 피펫을 사용하여 15 ML 튜브에 미리 예열 완전한 NI 매체 7 ML에서 세포를 수집합니다. 3 분 130 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 제거하고 천천히 μl 피펫을 사용하여 완전한 NI 매체 1 ML에 세포를 resuspend. 추가로 완전한 NI 배지 3 또는 4 ML에 세포 현탁액을 희석하고 trypan 블루 및 자동 셀 카운터를 사용하여 세포를 계산합니다 (참고 : trypan 블루 20 μL에 세포 현탁액을 희석 20 μL, 해동 후 생존 능력은 ≥ 80이어야합니다 %). 코팅 된 60 – mm 페트리 접시 (또는 T25 플라스크)에 NSCs를 약 50,000 세포 / cm 2 의 밀도로 플레이트하십시오. 5. 채라hiPSC 유래 신경 세포 및 신경 교세포의 체화 참고 : 차별화, 신경 및 glial 파생 상품은 다음 섹션에서 설명하는 것과 같은 다른 기술을 사용하여 특성 수 있습니다. 정량 실시간 PCR (qPCR) 분석 10 3 분 동안 130xg에서 hiPSC 콜로니 단편, EBs 및 / 또는 NSCs를 스핀 다운하십시오. RNA 추출을위한 적절한 키트에 제공된 차가운 RNA 용해 버퍼 100 μL에 세포 펠렛을 Resuspend. 또는 매체를 흡인하고 세포를 수집하는 우물에 차가운 RNA 용해 버퍼를 추가하여 플레이트에서 직접 연결 / glial 유도체를 수집합니다. 제조자의 지시에 따라 RNA를 분리한다. RNA 역전사를위한 적절한 키트를 사용하여 500 ng의 total RNA를 역전사하십시오. 적절한 마스터 믹스 및 프라이머를 사용하여 qPCR 반응을 이중으로 실시하십시오.세트 ( 재료 표 참조). 실시간으로 형광 방출을 기록하십시오 : 60 ° C에서 어닐링하는 프라이머로 45 사이클. 상대적 RNA 양을 표준 유전자로서 GAPDH와 β-actin으로 표준화하고 보정 조건 (ΔΔCt 방법)을 위해 미분화 hiPSCs 또는 미처리 세포를 사용하십시오. 또는 다른 적절한 방법을 사용하십시오. Immunocytochemistry and high-content imaging (HCI) 6 , 11 차가운 4 % 파라 포름 알데히드로 hiPSC 콜로니, NSC 및 / 또는 신경 / glial 유도체를 실온에서 15 분 동안 고정시켰다. 부드럽게 1X PBS에서 세포를 씻어 최대 1 개월 동안 4 ° C에서 번호판을 저장하십시오. 얼룩이 준비가되면, permeabilization 버퍼 (0.1 % 트리톤 X – 100 및 3 % BSA를 포함하는 1x DPBS)에 실온에서 15 분 동안 세포 permeabilize. permeabilization bu 제거항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 상온에서 15 분 동안 블로킹 완충액 (3 % BSA / 1X DPBS)에서 세포를 배양하고 배양한다. 차단 버퍼를 제거하고 4 일 밤새 세포를 품어 ° C 적절한 원 항체를 포함하는 버퍼를 차단 (C의 표를 참조 ). 1X PBS로 세포를 3 번 ​​씻으십시오. DAPI 염료로 핵을 counterstaining, fluorochrome – 접합 보조 항체 ( 표 재료 참조)를 포함하는 버퍼를 차단에서 실온에서 45 분 동안 세포를 품어. 사용 가능한 경우 적합한 고감도 이미징 플랫폼을 사용하여 평균 형광 강도와 세포 유형의 상대 백분율을 정량화하십시오 ( 재료 표 참조). 주 : 형광 배경의 강도 수준을 결정하려면, 일부 세포 / 우물을 보조 항체와 함께 배양하십시오. 살아있는 (고정되지 않은), und의 유동 세포 계측 분석SSEA4와 같은 PSC 특이 마커의 발현을 평가하기 위해 ifipliated hiPSC를 수행 할 수 있습니다 ( 표 참조). 상업적으로 이용 가능한 BCIP / NBT 키트를 사용하여 제조 업체의 지침 ( 표 참조)에 따라 미분화 hiPSC 콜로니를 알칼라인 포스 파타 아제 활성에 대해 분석 할 수 있습니다. 또한, 참조 12 (시험 된 항체의 목록은 표를 참조)에서 설명한대로 역상 단백질 배열 (RPPA) 분석 및 분석을 수행 할 수 있습니다. 전기 생리 학적 측정 13 완전한 ND 배지 (~ 1 x 10 5 세포 / 단일 우물 MEA 칩)에서 코팅 된 다중 전극 배열 (MEAs : 표표 참조)의 로제트에서 유래 한 분리 된 로제트 조각 (7 DIV 이후) 또는 NSCs 를 플레이트 합니다. 완전한 ND 배지에서 3 주 동안 세포를 분화시키고,전자 매체를 일주일에 두 번. 분화가 끝나면 층류 후드 아래에서 반투막으로 MEA 칩을 밀봉하여 반복 측정을 위해 배양 물을 무균 상태로 유지합니다. 전극 중 하나를 접지 기준으로 바꾸고 나머지 전극의 기록을 허용하십시오. 37 ° C와 5 % CO2로 조정 된 통합 온도 공정 제어 기능이있는 MEA 증폭기를 사용하여 평균 발화 속도 (MFR, 스파이크 / 분 수)를 기록하십시오. 임계 한계 인 -4.7σ (σ는 기본 노이즈의 표준 편차를 나타냄)를 사용하여 MEA 원시 데이터의 피크를 감지합니다. 적합한 소프트웨어로 사후 기록 데이터를 처리하십시오.