På grund af de slående ligheder i livscyklus og biologi af gnavere malaria parasitter til humane malaria parasitter, gnaver malaria modeller er blevet uundværlig for malaria forskning. Heri, vi standardiseret nogle af de vigtigste teknikker, der anvendes i fænotypiske analyse af vildtype og transgene gnaver malaria arter.
Nylige fremskridt inden for Genetik og systemer biologi teknologier har fremmet vores forståelse af biologi malaria parasitter på molekyleniveau. Men, effektive malaria parasisite mål for vaccine og kemoterapi udvikling er stadig begrænset. Dette skyldes hovedsagelig, at der ikke findes relevante og praktiske in vivo -infektions modeller for humane Plasmodium arter, især for p. falciparum og p. vivax. Derfor, gnaver malaria arter er blevet flittigt anvendt som praktisk alternativ in vivo modeller for malariavaccine, Drug målretning, immunrespons, og funktionelle karakterisering undersøgelser af bevaret Plasmodiumspp. gener. Faktisk, gnaver malaria modeller har vist sig at være uvurderlig, især for at udforske myg transmission og leveren scenen biologi, og var uundværlige for immunologiske undersøgelser. Der er dog afvigelser i de metoder, der anvendes til at evaluere phenotyper af transgene og vildtype aseksuelle og seksuelle blod-scene parasitter. Eksempler på disse uoverensstemmelser er valget af en intravenøs vs. intraperitoneal infektion af gnavere med blod-fase parasitter og evaluering af mandlig gamet exflagellation. Heri, vi detaljeret standardiserede eksperimentelle metoder til at evaluere phenotyper af aseksuelle og seksuelle blod stadier i transgene parasitter udtrykker reporter-gen eller vild-type gnaven malaria parasitten arter. Vi også detaljer metoderne til at evaluere phenotyper af malaria parasitisk myg stadier (gametes, ookinetes, oocyster, og sporozoiter) inde Anopheles myg vektorer. Disse metoder er detaljeret og forenklet her for de dødbringende og ikke-dødelige stammer af p. berghei og p. yoelii men kan også anvendes med nogle justeringer af p. chabaudi og p. vinckei gnavere malaria arter.
Malaria parasitter forårsager hundredvis af millioner af malaria infektioner hos mennesker over hele verden, med mere end 600.000 dødsfald hvert år1. Humane infektioner forårsages af fem malaria parasiter, nemlig p. falciparum, p. vivax, p. ovale, p. malariaeog p. knowlesi. De fleste kliniske malaria MORTALITET er forårsaget af P. falciparum i Afrika syd for Sahara1. En anden Human malaria parasiter arter, der forårsager omfattende verdensomspændende morbiditeter uden for Afrika syd for Sahara er P. vivax2. De tre andre arter er alle mere geografisk begrænset og forårsage godartede malaria infektioner, undtagen den dødbringende P. knowlesi3. Den manglende adgang til relevante og praktiske ikke-humane in vivo-modeller af infektioner har altid været og er stadig en hindring for malariavaccine og lægemiddeludvikling. Tidligere malaria Drug målretning og metaboliske undersøgelser har påberåbt sig udførligt på aviær malaria modeller som p. gallinaceum og p. lophurae, inficere kyllinger og ænder, henholdsvis4. Derefter blev gnaver malaria arter gradvist introduceret i forskellige vacciner og stof målretning undersøgelser som in vivo-modeller. I årenes løb, beviser for ligheder i biologi og vært-parasisite interaktioner af livscyklus stadier af gnavere malaria modeller til menneskelige malaria arter har akkumuleret.
Især, gnaver malaria modeller var yderst vigtigt at udforske og karakterisere biologi af myg og præ-erythrocytiske stadier5. Men, der er fire gnaver malaria arter (p. berghei, p. yoelii, p. chabaudi, og p. vinckei), der har forskellige biologiske egenskaber, hvoraf den mest bemærkelsesværdige er i blodet faser6. Gnavere malaria arter adskiller sig i synkronicitet af blod stadier, hvor blod stadier af p. chabaudi og p. vinckei stammer er for det meste synkrone, mens blodets stadier af p. berghei og p. yoelii ikke er6 , 7. en anden bemærkelsesværdig forskel er den selvstændige clearance af blod stadier, der forekommer i nogle stammer (f. eks p. yoelii 17x-NL, p. berghei NK65, og p. vinckei lentum), mens blodinfektion af andre stammer af samme art kunne være dødelig, hvis venstre ubehandlet (p. yoelii 17x-L, p. berghei Anka, og p. chabaudi AS). Desuden, p. yoelii 17x-NL stamme og p. berghei Anka stamme fortrinsvis invadere reticulocytter8,9,10,11, selv om disse funktioner i P. yoelii og P. berghei stammer er ikke en streng vækst krav12,13,14. Derfor, mus er behandlet med phenylhydrazin før en infektion med blod stadier af disse parasitter til at øge parasitemia og gametocytemia nødvendig for en myg infektion for p. berghei Anka stamme og for p. yoelii 17x-NL15,16,17,18,19.
Forskelle i myg stadier udvikling også findes blandt forskellige gnavere malaria arter, den mest bemærkelsesværdige er den temperatur og tid, der kræves for optimale myg faser udvikling og sporozoite længde5,6, 20. I præ-erythrocytiske stadier af gnavere malaria arter, forskelle omfatter gnaverarter og stamme, der er mest modtagelige for infektiøs sporozoit inokulation, antallet af sporozoiter nødvendig for inokulation i en modtagelig gnaver stamme, pattedyrscelle typer, der er nødvendige til in vitro-udvikling af lever stadiet, og tid til at fuldføre udviklingen af lever stadiet5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
På trods af disse variabilitet, gnaver malaria parasitter var de gunstige modeller tidligt for anvendelsen af omvendte genetiske tilgange, fordi de var mindre tid-og ressourcekrævende med en høj sandsynlighed for succes31. Faktisk, gnaver malaria modeller var de bedste modeller, og i mange tilfælde de eneste modeller, der er tilgængelige i mange år til funktionelt karakterisere gener udtrykt i myg og leveren stadier.
I lyset af den popularitet og modtagelighed af omvendte genetiske tilgange i gnavere malaria modeller, en række forskellige metoder er blevet udnyttet til at analysere fænotyper af transgene parasitiske livscyklus stadier, især blod stadier. Nogle af disse metoder er imidlertid inkonsekvente; for eksempel, sammenligne infektioner i blod-fase parasitter efter en IP injektion (som muligvis drænet til peritonealdialyse lymfeknuder og, derfra, kan komme ind i blodbanen; derfor, de injicerede parasitter ikke ender lige i blodbanen) , sammenligne myg transmission af kloner med et andet antal serielle blod-Stage overførsler eller G-nummer (som kan påvirke gametocytogenesis32,33), eller sammenligne transgene parasitter direkte til naive vildtype (WT) parasitter, der aldrig blev udsat for elektroporation og positive Drug udvælgelse og de forskellige ustandardiserede evalueringer af mandlig gamet exflagellation. Derfor er det afgørende at standardisere protokoller, der er enkle at følge for fænotypiske analyse af enhver form for transgene eller WT gnavere malaria parasitter i blodet og i myg til at rumme for de biologiske intra af gnavere malaria parasiter.
Heri, rapporterer vi om en standardiseret, detaljeret forsøgsprotokol for fænotypisk analyse af blod og myg livscyklus stadier af transgene eller vild-type p. yoelii og p. berghei parasitter. Disse protokoller gælder også for p. chabaudi og p. vinckei parasitter.
På trods af ligheden i den generelle biologi i deres liv cykler til at af menneskelige malaria parasitter, mus malaria modeller har også mange forskelle til menneskelige Plasmodium arter, der ville begrænse deres anvendelse som pålidelige in vivo modeller. For eksempel, med undtagelse af levende svækkede parasitter som vacciner, alle vaccine undersøgelser med underenhed og DNA og andre vacciner gav fremragende resultater i musemodel, men hos mennesker, der bor i endemiske områder, resultaterne va…
The authors have nothing to disclose.
Ahmed Aly understøttes af finansiering til Bezmialem Vakif University fra det tyrkiske ministerium for udviklingstilskud 2015BSV036, og ved hjælp af midler fra Tulane University School of Public Health og Tropical Medicine, og ved at støtte fra NIH-NIAID for R21Grant 1R21AI111058-01A1.
Heparin | Sigma | 375095-100KU | |
Xanthurenic acid | Sigma | D120804-5G | |
Hypoxanthine | Sigma | H9377-25G | |
Alsever's solution | Sigma | A3551-500ML | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
Phenylhydrazine | Sigma | P26252-5G | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
Giemsa | Sigma | GS1L-1L | |
26G x 3/8 Precision Glide Needle, | Becton Dickinson | 305110 | |
1 ml TB Syringe, 26G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
1 cc Insulin Syringe, U-100 27G | Becton Dickinson | 329412 | |
Isoflurane, USB | Piramal | 2667- 46- 7 | |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
RPMI | Gibco | 22400105 | |
DMEM | Gibco | 11995065 | |
Pencillin/ Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
Fiber Glass Wool | Corning | 3950 |