El método descrito ha permitido el registro preciso de las corrientes unitarias fundamentales que generan golpes cuánticos espontáneos y evocados por la luz, que suman para producir la respuesta macroscópica a la luz, en condiciones definidas. También permitió la comparación entre las moscas de tipo salvaje y mutantes que tienen defectos en las moléculas críticas de señalización ( Figuras 3 y 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Además, la capacidad de medir el potencial de inversión en condiciones bi-iónicas reveló propiedades biofísicas fundamentales de TRP y TRP-como (TRPL) canales [ 18 , 19] . También permitió la medición de los efectos de las sustituciones de aminoácidos en la región de poros de TRP que modificó su Ca 2 +Permeabilidad 20 . La respuesta lumínica obtenida por las grabaciones de células enteras de pinzas de parche depende linealmente de la intensidad de la luz durante al menos 4 órdenes de magnitud. Esto no pudo ser resuelto mediante el uso de ERG y métodos de registro intracelular. Por consiguiente, una serie de respuestas a breves destellos de intensidad creciente y una gráfica de la función de respuesta de intensidad revelaron una linealidad estricta de la respuesta instantánea con una intensidad luminosa creciente. La linealidad estricta sostiene por lo menos varios cientos de pA, pero es discutible si a partir de entonces es la linealidad o control de la abrazadera que se rompe ( Figura 6 ). Estos resultados sugieren que las respuestas macroscópicas a la luz son una suma lineal de las respuestas unitarias a la luz ( es decir, golpes cuánticos). Se ha establecido bien mediante grabaciones de voltaje que la luz tenue estimulación indFluctuaciones de voltaje discretas ( es decir, golpes cuánticos) en la mayoría de las especies de invertebrados. Los golpes cuánticos de D. melanogaster resultan de la apertura concertada de ~ 15 canales TRP y ~ 2 canales TRPL en el pico de la protuberancia 18 . Cada bache es generado por la absorción de un solo fotón, mientras que la respuesta macroscópica a luces más intensas es la suma de estas respuestas elementales 14 , 21 . Los baches varían significativamente en latencia, tiempo y amplitud, incluso cuando las condiciones de estímulo son idénticas. La generación de topes es un proceso estocástico descrito por las estadísticas de Poisson, en el que cada fotón efectivamente absorbido provoca sólo una protuberancia. La relación single-bump de fotón único requiere que cada paso en la cascada incluya no sólo un eficiente mecanismo de activación, sino también un mecanismo de "apagado" igualmente eficaz. La ventaja funcional es la producción de unContador de fotones muy sensible con una respuesta transitoria rápida muy adecuada tanto a la sensibilidad como a la resolución temporal requerida por el sistema visual. El requisito de un mecanismo de apagado eficaz se revela cuando el fotopigmento activo ( es decir , metarhodopsina, M) o su objetivo, el Gq $ α $, falla en inactivarse y conduce a la producción continua de bultos mucho tiempo después de que se apaga la luz ( Figura 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . La protuberancia representa la actividad cooperativa de los canales TRP / TRPL en un microvillus. Como tal, cualquier hipótesis de activación de canal debería explicar también la activación cooperativa del canal. Recientemente, Hardie y sus colegas han demostrado que la luz evoca contracciones rápidas de los fotorreceptores, lo que sugiere que la sensibilidad a la luzLos canales e (TRP / TRPL) pueden ser cerrados mecánicamente 25 . Esta activación mecánica, junto con los protones observados liberados por PIP mediada por la hidrólisis PIP 2 , promover la apertura de los canales TRP / TRPL y explicar la naturaleza cooperativa de la producción de topes [ 26] . En la actualidad, los fotorreceptores de melanogaster de D. melanogaster son uno de los pocos sistemas en los que se pueden estudiar los canales de señalización de fosfoinositidos y TRP in vivo , lo que hace que la fototransducción de D. melanogaster y la metodología desarrollada para estudiar este mecanismo sean un sistema modelo muy valioso. Figura 3: Los mutantes inaC P209 e inaD P215 revelan la terminación de respuesta lenta de la respuesta macroscópica a la luz y de los solapamientos de un solo Quantum. ( A ) El aislado prema de ommatidiumCon una pipeta de parche llena de colorante Lucifer Yellow CH fluorescente (excitación: 430 nm, emisión: 540 nm) durante una grabación de células enteras. Obsérvese que el colorante fluorescente difundió y etiquetó un solo cuerpo de célula fotorreceptor y que los cuerpos de células fotorreceptoras se separan de sus axones alargados pero aún mantienen la viabilidad. Esta preparación es adecuada para grabaciones simultáneas de células enteras y experimentos de formación de imágenes. ( BD ) Paneles superiores: Respuesta de voltaje de células enteras a las luces débiles continuas (barra abierta) en WT, inaC P209 y inaD P215 . Se observa una terminación lenta de los baches en los mutantes inaC P209 e inaD P215 en relación con las moscas WT. La inserción de abajo muestra la forma ampliada de solapas. Paneles inferiores: La célula entera normalizada registró las respuestas macroscópicas a un pulso luminoso de 500 ms (1,5 x 10 5 fotones por s) del tipo salvaje anterior Y moscas mutantes. (EG) Paneles superiores: Respuestas de choque cuántico con voltaje de la célula entera a una luz breve (1 ms), provocando respuestas de un solo fotón en las moscas mutantes de tipo salvaje, arr2 3 y ninaC P235 . Obsérvese el tren de colisiones observado en las moscas mutantes arr2 3 y ninaC P235 en respuesta a una sola absorción de fotones. Paneles inferiores: El voltaje de la célula entera sujetó las respuestas normalizadas a un pulso luminoso de 500 ms (1,5 x 104 fotones / s) en los mutantes correspondientes. Obsérvese la terminación lenta de las respuestas macroscópicas observadas en arr2 3 Y ninaC P235 mutante moscas en relación con WT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. D / 55627 / 55627fig.jpg "/> Figura 4: Celular Ca 2 + Dynamics Siguiendo la señal inducida Ca 2 + Influjo es afectado por Calphotin. Una serie de tiempo de fotorreceptor imágenes de tipo salvaje y Cpn 1% moscas que muestra la fluorescencia del Ca 2 + indicador durante la estimulación de luz. Las imágenes de intensidad bruta se representan mediante la codificación de falsos colores (barra = 10 μm, las puntas de flecha indican la pipeta). Figura reimpresa con permiso de Weiss et al. 4 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Propiedades electrofisiológicas de los mutantes WT, trp y trpl. ( A ) Abrazadera de voltaje de la célula entera reco(Bum) en WT, trpl 302 y trp P343 moscas mutantes nulas. Se observan amplitudes altamente reducidas de trp P34 3 protuberancias. Recuadro: Se muestran los solos quánticos amplificados únicos de las moscas mutantes nulas de tipo salvaje y trp P343 . ( B ) Grabaciones de sujeción de voltaje de células enteras en respuesta a un impulso luminoso de 3 s de tipo salvaje y los mutantes correspondientes. Se observa la respuesta transitoria de estado estacionario del mutante trp P343 . Inserción: se muestran las respuestas de luz ampliada de WT y mutante trp P343. ( C ) Una familia de corrientes inducidas por la luz superpuestas de las cepas de mosca anteriores, obtenidas en respuesta a un impulso de luz de 20 ms, a intervalos de voltaje de 3 mV, medida alrededor del potencial de inversión (E rev ). ( D ) Un histograma que representa la media E rev de tipo salvaje y los diversos mutanTs Las barras de error son el SEM El potencial de inversión (E rev ) de WT está entre el positivo E rev de trpl 302 , que expresa sólo TRP, y el E rev del trp P343 mutante nulo, que expresa sólo TRPL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: La respuesta del flash es estrictamente lineal con el aumento de la intensidad de la luz. Una serie de respuestas de corriente a breves destellos de aumento de la intensidad de luz y un gráfico de la dependencia de la amplitud de pico de la respuesta de luz sobre la intensidad creciente de luz breve parpadea. Esta relación revela una linealidad estricta entre la respuesta instantánea y el aumento de la intensidad luminosa. Esta estricta linealidadSe mantiene hasta por lo menos varios cientos de pA, con una intensidad de luz que abarca más de 4 órdenes de magnitud, mientras que es discutible si es la linealidad o el control de la abrazadera que se rompe a continuación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. PH 7,15 (ajustar con NaOH) Reactivo Concentración (mM) NaCl 120 KCl 5 MgCl $ ₂ $ 4 TES 10 Prolina 25 Alanina 5 Almacenar a -20 ° C. <td colspan= "2"> Nota: Esta solución es nominalmente libre de Ca2 + pero no tiene tampones de Ca2 + añadidos y por lo tanto tendrá aproximadamente 5 – 10 μM de traza de Ca2 + . Solución extracelular (ES) = ES-0Ca2 + con CaCl2 1,5 mM, preparada añadiendo CaCl2 a partir de una solución madre 0,5 o 1 M a ES-0Ca2 + . Tabla 1: Solución extracelular libre de Ca +2 (ES). Descripción química y las cantidades específicas requeridas para producir ES libre de Ca +2 . Reactivo Cantidad FBS 15 ml Sacarosa 1,5 g Se divide en alícuotas de 150 μL en viales de 1,5 ml y se almacena a -20ºC. 76; C. Solución de trituración (TS) Llenar 1 vial de 150 mL de la solución madre con 1.350 mL ES o ES-0Ca 2+ , para que coincida con la solución utilizada durante la disección. Tabla 2: Suero Bovino Fetal (FBS) + Sacarosa – Solución Stock. Descripción química y las cantidades específicas requeridas para producir suero bovino fetal (FBS) + solución de sacarosa – stock. PH 7,15 (ajustar con KOH) Reactivo Concentración (mM) Gluconato de potasio (Kglu) 140 MgCl $ ₂ $ 2 TES 10 La sal de magnesio ATP (MgATP) 4 GTP (Na _ { 2 } GTP) 0,4 Β-nicotinamida adenina dinucleótido hidrato (NAD) 1 Almacenar a -20 ° C. TABLA 3 Solución intracelular (IS1). Descripción química y las cantidades específicas requeridas para producir IS1, que se utiliza sobre todo para la respuesta de la intensidad y las medidas del choque del quántum. PH 7,15 (ajustar con CsOH) Reactivo Concentración (mM) CsCl 120 MgCl $ ₂ $ 2 TES 10 La sal de magnesio ATP (MgATP) 4 GTP (Na _ { 2 } GTP) 0,4 Β-nicotinamida adenina dinucleótido hidrato (NAD) 1 El cloruro de tetra-etil-amonio (TAE) 15 Almacenar a -20 ° C. Tabla 4: Solución intracelular (IS2). Descripción química y las cantidades específicas requeridas para producir la solución intracelular IS2, que se utiliza sobre todo para las medidas del potencial de inversión de la corriente inducida por la luz.