单分子水平的高精度FRET用于生物分子结构测定

结构生物学研究的一个基本目标是揭示生物分子机器的结构与功能之间的关系。生物分子（ 例如，蛋白质和核酸）的第一个视觉印象发生在20世纪50年代，通过开发X射线晶体学^1,2 。 X射线晶体学提供了由晶体包装约束的高分辨率静态结构信息。因此，X射线结构模型的固有不动性可以避免生物分子的动态性质，这是影响大多数生物学功能的因素^3,4,5 。核磁共振（NMR） ^6,7,8提供了解决水溶液中结构模型的问题的替代方案。一个很大的优势的NMR是其恢复生物分子和构象集合的内在动力学特性的能力，有助于阐明结构，动力学和功能之间的内在关系3,4,5。然而，由样品量和大量样品限制的NMR对较大系统需要复杂的标记策略。因此，迫切需要开发结构生物学中的替代方法。

历史上，Förster共振能量转移（FRET） ⁹在结构生物学中没有发挥重要作用，因为FRET提供了低精度距离测量的误解。该协议的目的是重新审视FRET确定纳米尺度的距离，使得这些距离可用于构建生物分子的结构模型。第一个实验验证通过测量各种长度的聚合物作为“光谱尺”，1967年^10号由Stryer在FRET效率方面的依赖性。在2005年的单分子水平上完成了类似的实验¹¹ 。聚脯氨酸分子被证明是非理想的，因此后来使用双链DNA分子¹² 。这打开了精确距离测量的窗口和使用FRET识别生物分子的结构特性的想法。

当干涉距离范围为〜0.6-1.3 R ₀时，FRET最佳，其中R ₀是Förster距离。对于在单分子FRET实验中使用的典型荧光团， R ₀为〜50。通常，与其他方法相比，FRET在解决和区分结构和动态的能力方面提供了许多优势异质系统：（i）由于荧光的最终灵敏度，单分子FRET实验13,14,15,16可以通过直接计数和同时表征其各个成员的结构来解析异质集合。 （ii）复合反应途径可以在单分子FRET研究中直接解密，因为不需要整体的同步。 （iii）FRET可以及时访问跨越十多年的各种时间领域，涵盖各种各样的生物相关动态。 （iv）FRET实验可以在体外和体内的任何溶液条件下进行 。 FRET与荧光显微镜的组合允许直接在活细胞中研究分子结构和相互作用^{15,16 ，} </ sup> ^{17，18，19 ，}甚至高精度²⁰ 。 （v）FRET可以应用于几乎任何大小的系统（ 例如，聚脯氨酸低聚物21,22,23,24，Hsp90 ²⁵ ，HIV逆转录酶²⁶和核糖体²⁷ ）。 （vi）最后，包含生物分子的所有维度的距离网络可用于导出静态或动态分子的结构模型18,28,29,30,31,32,33,34 ^，参考“> 35,36,37。

因此，单分子FRET光谱可用于导出足够精确的距离以用于距离限制结构建模²⁶ 。这可以通过利用八维尺寸的荧光信息（ 即激发光谱，荧光光谱，各向异性，荧光寿命，荧光量子产率等）的多参数荧光检测（MFD）28,38,39,40,41,42的优点，宏观时间，荧光强度和荧光团之间的距离）精确而准确地提供距离限制。另外，脉冲交错激励（PIE）与MFD组合（PIE-MFD） ⁴²以监测直接激发受体荧光并选择由含有1：1供体 – 受体化学计量的样品产生的单分子事件。典型的PIE-MFD设置使用连接到共聚焦显微镜主体的双脉冲交错激光激光器，其中光子检测在不同光谱窗口和偏振特性中分为四个不同的通道。更多细节见图1 。

重要的是要注意，FRET必须结合计算方法来实现与FRET结果26,30相符合的类原子结构模型。目前的协议的目的不在于使用FRET衍生距离来构建结构模型的相关方法。然而，这些方法已经与其他技术（ 例如，小角度X射线散射）结合使用或电子顺磁共振），产生了整合结构生物学领域43,44,45,46。目前的目标是为FRET作为结构生物学的定量工具铺平道路。作为示例，该方法用于鉴定N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体的配体结合结构域（LBD）中的三种构象状态。最终的目标是克服上述限制，并通过提供高精度的测量距离将FRET引入用于结构测定生物分子的综合方法。