Une manière non invasive d'isoler et de phénotype des cellules de la conjonctivite
Summary
La surface oculaire normale exposée est constituée de cornée et de conjonctive. Les cellules épithéliales, les cellules caliciformes et les cellules immunitaires sont présentes dans la conjonctive. Ici, une technique non invasive de cytologie d'impression est décrite en utilisant un dispositif de cytologie d'impression et une cytométrie de flux pour analyser les cellules immunitaires dans la conjonctive.
Abstract
Traditionnellement, la cytologie de surface oculaire est étudiée avec des techniques telles que la technologie des spatules et la technologie de la brosse. Le problème avec ces techniques est qu'elles peuvent induire des lésions traumatiques à la surface de l'œil, qui peuvent progresser vers les cicatrices, la déformation des paupières, la carence en cellules souches limbales et, dans certains cas, causer un grand inconfort au sujet. Pour éviter ces problèmes cliniques, la cytologie d'impression (IC) a été développée pour diagnostiquer une maladie des yeux secs et plus tard une néoplasie, une maladie atopique, une kératoconjonctivite verte et une kératoconjonctivite sicca. Généralement, les cliniciens coupent manuellement les papiers filtrants dans les formes requises et les appliquent à la surface oculaire. Ici, nous décrivons comment effectuer l'IC à l'aide d'un dispositif médical disponible dans le commerce. Cette technique est expliquée ici, suivie d'un immunophénotypage par cytométrie de flux. Cette technique nécessite moins de manutention manuelle et cause moins de blessures à la surface oculaire.
Introduction
La cytologie d'impression (IC) a d'abord été réalisée en 1977 par Thatcher et al . 1 . Ils ont utilisé un disque d'impression plastique pour collecter les cellules conjonctivales des patients au lieu d'autres techniques disponibles à ce moment-là, telles que le raclage, le tamponnage ou le pipetage 1 . La technique actuelle de l'IC utilise un papier filtre absorbant 2 pour imprimer la conjonctive bulbeuse et palpebrale et collecter la couche la plus superficielle des cellules conjonctivales. Ces cellules, ayant atteint leur stade final de différenciation, se répandent continuellement dans les larmes 3 . Trois cellules majeures de cellules se trouvent dans les spécimens de CI: cellules épithéliales 4 , cellules caliciformes 3 , 5 et tissu lymphoïde associé aux muqueuses, à savoir des cellules T effectrices associées à l' épithélium ou des cellules dendritiques 6 . Cellules de surface oculaire dans IC samLes analyses peuvent être analysées par microscopie, immunotransbrantation et réaction en chaîne par polymérase en transcriptase inverse (RT-PCR) 7 . La cytométrie de flux a récemment été utilisée pour analyser les cellules immunitaires collectées en grattant la membrane IC 8 . Fait intéressant, IC 6 , 9 a été utilisé pour évaluer de nombreuses maladies de la surface oculaire, y compris la keratoconjonctivite sicca, la carence en vitamine A, la pemphigoïde cicatricielle, la maladie atopique, la kératoconjonctivite limbique supérieure, la kératoconjonctivite vernal et la métaplasie squameuse épithéliale. IC a également été utilisé pour évaluer l'impact du port de lentilles de contact, détecter les microbes de surface oculaire et tester l'efficacité thérapeutique et la tolérance des interventions thérapeutiques dans les études longitudinales 10 , 11 , 12 .
Le dispositif médical (EyePrim) est pris en charge par un type de polyLa membrane d'éthersulfone (PES) de 0,2 μm, validée pour la technique de la cytologie d'empreinte oculaire avec cytométrie de flux (OSIC-flow) et ouvre des possibilités d'échantillonnage longitudinal pour surveiller la progression de la maladie et la réponse au traitement ( p . Ex . Analyse des leucocytes intra-épithéliaux définis comme des marqueurs putatifs de la maladie pour une fibrose conjonctivale progressive dans la pemphigoïde des muqueuses) 13 . Les premiers chercheurs ont utilisé des filtres PES autoclavés qui nécessitaient une impression manuelle. En conséquence, le rendement était variable et dépendait de l'utilisateur. L'avantage de ce dispositif médical est la facilité d'utilisation, la pression standardisée (Pa ou N / m 2 ), et permet la répétabilité, la reproductibilité et la récupération cellulaire cohérente. Cette technique est utile dans une clinique ambulatoire car elle n'est pas chirurgicale, facile à réaliser et rapide. Il s'agit d'un dispositif médical de classe I (stérile) selon la directive 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Cela nécessite seulementS anesthésie topique pendant la procédure, ce qui assure le maintien de l'intégrité de la surface oculaire. Après IC, les cellules peuvent être traitées immédiatement pour la cytométrie en flux. En outre, il est possible pour les techniciens non-ophtalmologiques et les infirmières d'être formés pour échantillonner la surface oculaire.
Malgré l'amélioration de l'IC sur d'autres techniques, plusieurs défis demeurent. Par exemple, il peut y avoir des variations en raison de la zone de l'échantillonnage et des différences régionales dans la conjonctive bulbaire en fonction de la position de l'IC. Une autre source de variation est due à l'application de différentes quantités de pression pendant l'IC. D'autres problèmes méthodologiques impliquent la normalisation du traitement cellulaire: ceux-ci impliquent une durée et une méthode de fixation, ainsi que les conditions de stockage possible, ce qui peut avoir une incidence sur la stabilité du matériau échantillonné.
L'objectif global de cette technique est de développer une méthode d'isolement des échantillons d'empreintes oculaires thaT est facile à utiliser, non invasif et peut être appliqué à la caractérisation immunologique des échantillons cliniques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il s'agit d'une technique facile, rapide et moins invasive qui peut être utilisée dans les cliniques ambulatoires pour un profil immunitaire relativement rapide contrairement aux techniques classiques comme le grattage, le tampon, le pipetage ou le papier filtre absorbant 1 , 2 . Une variante de cette technique est déjà utilisée dans les paramètres de recherche 22 . L'application future de la méthodologie proposée est la stratification des patients dans les essais cliniques avec des maladies oculaires, en particulier ceux nécessitant un immunophénotypage.
Un défi majeur avec cette technique est le nombre relativement peu de cellules immunitaires récupérées après la collecte et le raclage des empreintes. Le nombre total de lymphocytes T CD3 + récupérés à partir de quatre impressions par individu variait de ~ 500 à 1000 cellules. Les échantillons oculaires ont été lavés avant l'analyse de cytométrie en flux pendant un nombre minimal de fois pour éviter une perte supplémentaire de cellulesS. Les étapes et les défis critiques qui subsistent dans le protocole sont la collecte efficace d'échantillons oculaires et le raclage correct de la membrane pour atteindre un nombre de cellules plus élevé. Néanmoins, il est peu probable que cette limitation entraîne un biais vers un phénotype immunitaire spécifique. Le dépannage effectué ici pour maximiser le rendement des cellules était de réduire le nombre d'étapes de lavage après et avant l'incubation des anticorps.
Il existe d'autres limitations à l'utilisation de l'IC. Chez les patients atteints de surface oculaire gravement kératinisée ou fibrosée, comme dans le syndrome de Steven Johnson, le rendement cellulaire peut être encore inférieur à celui de cette étude. La proportion de cellules immunitaires peut changer si les échantillons sont stockés au lieu d'analyser le même jour. Il est difficile de prédire si certains types de cellules sont plus résistants au stockage que d'autres. Des études antérieures ont rapporté des niveaux élevés d'expression de HLA-DR dans les cellules épithéliales conjonctivales 23 , donc ce serait interAfin d'évaluer la corrélation entre HLA-DR et les niveaux de cellules immunitaires spécifiques. Les cellules immunitaires peuvent également être associées au niveau d'expression des chimiokines. Ces questions devraient être abordées dans les études futures.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier Nandini Nallappan et Sharon Yeo d'avoir aidé aux étapes techniques. L'étude a été financée par une Subvention de démarrage à KGC de l'École de médecine Lee Kong Chian, de l'Université technologique de Nanyang et d'un Prix principal des scientifiques cliniciens du Conseil national de recherches médicales (NMRC) du Ministère de la Santé de Singapour à LT (NMRC / CSA / 045/2012) et par une subvention du NMRC et administrée par le Centre national d'innovation en santé à KGC et LT (NHIC-12D-1409007).
Materials
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
Riferimenti
- Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. Conjunctival impression cytology. Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).
- Baudouin, C. The pathology of dry eye. Surv Ophthalmol. 45, S211-S220 (2001).
- Nelson, J. D., Wright, J. C. Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease. Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).
- Brignole, F., et al. Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders. Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).
- Knop, E., Knop, N. The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection. J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).
- Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology. Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).
- Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry. Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article. Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).
- Calonge, M., et al. Impression cytology of the ocular surface: a review. Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).
- Haller-Schober, E. M., et al. Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome. Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).
- Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. Impression cytology of the ocular surface. Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).
- Williams, G. P., et al. Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).
- Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. Clinical evaluation of the Oculus Keratograph. Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).
- Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods. Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).
- Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).
- Shapiro, A., Merin, S. Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects. American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).
- Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine. Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).
- Behrens, A. Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations. Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).
- Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells. Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).
- Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease. Sci Rep. 7, 45312 (2017).
- Williams, G. P., et al. The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases. Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).
- Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis. Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).
