وهناك طريقة غير الغازية لعزل والنمط الظاهري الخلايا من الملتحمة
Summary
يتكون سطح العين الطبيعي المكشوف من القرنية والملتحمة. الخلايا الظهارية، وخلايا الكأس والخلايا المناعية موجودة في الملتحمة. هنا، يتم وصف غير الغازية، وتقنية الخلايا الانطباع باستخدام جهاز علم الانطباع والتدفق الخلوي لتحليل الخلايا المناعية في الملتحمة.
Abstract
تقليديا، يتم دراسة علم الخلايا السطحية العين مع تقنيات مثل تكنولوجيا ملعقة وتقنية الفرشاة. المشكلة مع هذه التقنيات هي أنها قد تحفز آفات صادمة على سطح العين، والتي يمكن أن تتقدم إلى تندب، تشوه الجفن، نقص الخلايا الجذعية الليمفاوية، وفي بعض الحالات، يسبب عدم الراحة الكبيرة للموضوع. لتجنب هذه المشاكل السريرية، تم تطوير علم الخلايا الانطباع (إيك) لتشخيص مرض جفاف العين والأورام في وقت لاحق، ومرض التأتبي، التهاب القرنية والقرنية الربيعي والتهاب القرنية المخروطية سيكا. عادة، يقوم الأطباء بقطع أوراق الترشيح يدويا إلى الأشكال المطلوبة وتطبيقها على سطح العين. هنا، نحن تصف كيفية تنفيذ إيك باستخدام جهاز طبي متاح تجاريا. يتم شرح هذه التقنية هنا تليها إمونوفينوتيبينغ عن طريق التدفق الخلوي. تتطلب هذه التقنية معالجة يدوية أقل وتسبب إصابة أقل في سطح العين.
Introduction
تم تنفيذ علم الخلايا الانطباع (إيك) لأول مرة في عام 1977 من قبل تاتشر وآخرون 1 . استخدموا قرص انطباع بلاستيكي لجمع خلايا الملتحمة من المرضى بدلا من التقنيات الأخرى المتاحة في ذلك الوقت مثل كشط، مسحة أو بيبتينغ 1 . الأسلوب الحالي من إيك يستخدم ورقة تصفية ماصة 2 لطباعة بصمة والملتحمة الجفن وجمع الطبقة الأكثر سطحية من خلايا الملتحمة. هذه الخلايا، بعد أن وصلت إلى المرحلة النهائية من التمايز، وتسليط باستمرار في البكاء 3 . تم العثور على ثلاث مجموعات رئيسية من الخلايا في عينات إيك: الخلايا الظهارية 4 ، خلايا الكأس 3 ، 5 ، والأنسجة اللمفاوية المرتبطة المخاطية بمعنى ظهارة المرتبطة الخلايا T المستجيب أو الخلايا الجذعية 6 . خلايا سطح العين في إيك سامبليس يمكن تحليلها بواسطة المجهري، المناعية و النشاف و عكس ترانسكريبتاس البوليميراز سلسلة من ردود الفعل (رت-ير) 7 . وقد استخدمت التدفق الخلوي في الآونة الأخيرة لتحليل الخلايا المناعية التي جمعتها كشط غشاء إيك 8 . ومن المثير للاهتمام، وقد استخدمت إيك 6 ، 9 لتقييم العديد من أمراض السطح العين بما في ذلك التهاب القرنية، التهاب الكبد القرني، ونقص فيتامين (أ)، الفقاع الفقري، مرض التأتبي، متفوقة التهاب القرنية القرنية، التهاب القرنية، التهاب الحلق القرنية الظهاري، والحؤول الحرشفية الظهارية. وقد استخدمت إيك أيضا لتقييم تأثير ارتداء العدسات اللاصقة، والكشف عن الميكروبات سطح العين، واختبار الكفاءة العلاجية والتسامح من التدخلات العلاجية في الدراسات الطولية 10 ، 11 ، 12 .
ويدعم الجهاز الطبي (إيبريم) من نوع من بوليإيثرسولفون (بيس) 0.2 ميكرون غشاء، والتي تم التحقق من صحة سابقا لتقنية الخلايا الانطباع العين مع التدفق الخلوي (تدفق أوزيك) ويفتح فرصا لاستخدام العينات الطولية لرصد تطور المرض والاستجابة للعلاج (على سبيل المثال ، مفصلة تحليل الكريات البيض داخل الظهاري المعرفة بأنها علامات المرض المفترضة للتليف الملتحمة التدريجي في الغشاء المخاطي الفقاعي الفقاعي) 13 . استخدم الباحثون في وقت مبكر المرشحات بيس تعقيمها التي تتطلب الانطباع اليدوي. ونتيجة لذلك، كان العائد متغير ويعتمد على المستخدم. ميزة هذا الجهاز الطبي هو سهولة الاستخدام، ضغط موحد (باسكال أو N / م 2 )، وتمكين التكرار، استنساخه، واستعادة الخلوية متسقة. هذه التقنية مفيدة في عيادة للمرضى الخارجيين لأنها غير الجراحية، وسهلة لأداء وسريعة. هذا هو الجهاز الطبي من الفئة الأولى (العقيمة) وفقا للتوجيه 93/42 / سي، سي 0499 (سنش). انها تتطلب فقطتخدير موضعي أثناء العملية، مما يضمن الحفاظ على سلامة سطح العين. بعد إيك، يمكن معالجة الخلايا على الفور لتدفق الخلوي. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن لفنيين غير العيون والممرضات لتدريبهم على عينة من سطح العين.
على الرغم من تحسن إيك على تقنيات أخرى، لا تزال هناك العديد من التحديات. على سبيل المثال، قد يكون هناك اختلاف بسبب مجال أخذ العينات والاختلافات الإقليمية في الملتحمة العلوية اعتمادا على موقف إيك. مصدر آخر من الاختلاف يرجع إلى تطبيق كميات مختلفة من الضغط خلال إيك. وتشمل القضايا المنهجية الأخرى توحيد معالجة الخلايا: وهذه تنطوي على مدة وطريقة التثبيت، وظروف التخزين الممكنة، والتي قد تؤثر على استقرار المواد العينة.
الهدف العام من هذه التقنية هو تطوير طريقة عزل عينات الانطباع العين ثار هو سهل الاستخدام، غير الغازية ويمكن تطبيقها على توصيف المناعي للعينات السريرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه هي تقنية سهلة وسريعة وأقل الغازية التي يمكن استخدامها في العيادات الخارجية لتنميط المناعة نسبيا نسبيا على النقيض من التقنيات التقليدية مثل كشط، مسحة، بيبتينغ أو ورقة تصفية ماصة 1 ، 2 . وهناك نوع آخر من هذه التقنية يستخدم بالفعل في إعدادات البحث 22 . التطبيق المستقبلي للمنهجية المقترحة هو لطبقية المرضى في التجارب السريرية مع أمراض العين، وخاصة تلك التي تتطلب المناعي.
التحدي الرئيسي مع هذه التقنية هو عدد قليل نسبيا من الخلايا المناعية استرجاعها بعد جمع الانطباع وكشط. وتراوح العدد الكلي للخلايا CD3 + T المستعادة من أربعة انطباعات لكل فرد من 500 ~ 1000 خلية. تم غسل عينات العين قبل تحليل التدفق الخلوي لعدد ضئيل من المرات لتجنب المزيد من فقدان الخليةالصورة. الخطوات والتحديات الحاسمة التي لا تزال داخل البروتوكول هي جمع كفاءة عينات العين والكشط الصحيح من الغشاء لتحقيق أرقام الخلايا أعلى. ومع ذلك، فإن هذا القيد من غير المرجح أن التحيز تجاه أي النمط الظاهري المناعي محددة. كان استكشاف الأخطاء وإصلاحها أجريت هنا لتحقيق أقصى قدر من العائد من الخلايا للحد من عدد من الخطوات الغسيل بعد وقبل حضانة الأجسام المضادة.
هناك قيود أخرى لاستخدام إيك. في المرضى الذين يعانون من سطح العين شديدة الكيراتين أو فيبروزد مثل في متلازمة ستيفن جونسون، قد يكون العائد الخلوي أقل من ذلك في هذه الدراسة. قد تتغير نسبة الخلايا المناعية إذا تم تخزين العينات بدلا من تحليلها في نفس اليوم. ومن الصعب التنبؤ بما إذا كانت أنواع معينة من الخلايا أكثر مقاومة للتخزين من غيرها. وقد ذكرت الدراسات السابقة مستويات مرتفعة من التعبير هلا-در في الخلايا الظهارية الملتحمة 23 ، لذلك سيكون من بينتقييم لتقييم العلاقة بين هلا-در ومستويات الخلايا المناعية المحددة. ويمكن أيضا أن ترتبط الخلايا المناعية مع مستوى التعبير من تشيموكينس. وينبغي معالجة هذه المسائل في الدراسات المقبلة.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا نانديني نالابان وشارون يو للمساعدة في الخطوات التقنية. وقد تم تمويل الدراسة من قبل منحة البدء ل كغ من مدرسة لي كونغ شيان للطب، جامعة نانيانغ التكنولوجية، ومن قبل جائزة عالم السريرية العليا من المجلس الوطني للبحوث الطبية وزارة الصحة في سنغافورة (نمرك) ل لوت (نمرك / سسا / 045/2012 م) ومنحة مقدمة من المركز الوطني لمكافحة الجراد الصحراوي (نمرك) وتدار من قبل المركز الوطني للابتكار الصحي إلى كك و لوت (نهيك-12D-1409007).
Materials
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
Riferimenti
- Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. Conjunctival impression cytology. Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).
- Baudouin, C. The pathology of dry eye. Surv Ophthalmol. 45, S211-S220 (2001).
- Nelson, J. D., Wright, J. C. Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease. Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).
- Brignole, F., et al. Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders. Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).
- Knop, E., Knop, N. The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection. J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).
- Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology. Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).
- Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry. Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article. Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).
- Calonge, M., et al. Impression cytology of the ocular surface: a review. Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).
- Haller-Schober, E. M., et al. Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome. Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).
- Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. Impression cytology of the ocular surface. Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).
- Williams, G. P., et al. Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).
- Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. Clinical evaluation of the Oculus Keratograph. Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).
- Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods. Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).
- Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).
- Shapiro, A., Merin, S. Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects. American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).
- Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine. Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).
- Behrens, A. Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations. Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).
- Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells. Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).
- Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease. Sci Rep. 7, 45312 (2017).
- Williams, G. P., et al. The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases. Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).
- Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis. Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).
