多層皮質Ca²⁺プリズムプローブと小型蛍光顕微鏡を用いて自由に動くマウスのイメージング

動物被験者に関する手順は、カリフォルニア州NASAエイムズリサーチセンターのLifeSource Biomedical Servicesで機関動物管理および使用委員会（IACUC）によって承認されています。 1.手術前の準備ホットビーズ滅菌器で外科的処置に使用する器具を滅菌し、70％エタノールで手術部位を拭く。定位固定ステージ上に置かれた加熱パッドをオンにし、37℃で維持する。 イソフルラン（誘導の場合は5％、維持の場合は1〜2％、O 2の場合は0.6〜0.8L）を使用して動物を麻酔する。麻酔深度を評価するためにつま先のつまみがないことを確認します。 耳と歯のバーが取り付けられた定位フレームに動物を乗せる。 動物の眼に眼科用軟膏を塗布し、暗い紙で覆い、乾燥や激しい外科手術の灯りから保護します。 ケトプロフェンを動物に皮下注射する（2.5mg / kg）またはカルプロフェン（2.5mg / kg） 2.ウイルス注射手術目と耳の間の頭皮をトリミングして削り、70％エタノールとベタジンの3つの交互スワブで皮膚を消毒する。 頭皮に切開を入れ、目の間を開始し、滅菌外科用ブレードで1.5cmの吻側吻合部まで伸ばして、頭蓋骨を露出させる。頭蓋骨を露出させるために皮膚を開き、綿棒とメスを使用して、所望の注射部位の周りの骨膜を除去する。滅菌PBSで頭蓋をすすいでください。頭皮を清潔にし、綿棒で磨く。 頭蓋骨を水平にし、マーカーでウイルス注射の定位座標をマークします。高速マイクロドリル（約7,000〜10,000rpmに設定）に0.5mmバリを使用して、頭蓋骨に小さな穴を作ります。穿孔中にわずかな圧力を加え、断続的に骨の埃をきれいにし、滅菌したPBSでその領域を湿らせて、脳組織が過熱するのを防ぐ痛い穴が掘られたところで脳を湿らせてください。 マイクロシリンジでウイルス（ 例： AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40）を拾うためには26Gの針を使用し、注射用には35Gの針で置き換えます。ウィルスが付着したマイクロシリンジを定位固定装置のマニピュレータアームに取り付ける。 シリンジを注射部位の穴に近づけ、針の角度を調節して脳の表面に対して90°の角度で入るようにします。硬膜に触れるまで針を下げ、硬膜を貫通させます。針が所望の深さ（z）に達するまで、10μm/ sの増分で針を下降させ始める。定位腕を使用して針の位置を固定する。 25 nL /分でウイルスの250 nLを注入するようにマイクロシリンジポンプを設定します。 重要なステップ：注射するウイルスの量はタイターと希釈に依存するので、予め希釈実験を行い、細胞を画像化するための最適な容量と濃度の基準を確立する実験ではいくつかのウイルスが注射部位から出て見える場合は、注射を一時停止し、脳組織がウイルス液滴を吸収するまで待つ。全容量を注入してから5〜7分間待ってから、針を引っ込める。ウイルスが脳表面から出て見える場合に、注射速度を制御するのを助けるために、ファストグリーンのような色素をウイルス溶液に添加することもできる。 皮質の複数の層にラベルを付けるには、必要に応じて複数回の注入を行います。最初に腹側の部位で開始し、注射後5〜7分待ってから、注射のために次の最も背側の点に針を引き上げる（ 例えば 、-1.0mm AP、1.5mm±MLおよび400および600μmで注射する） DV）。最終注射から10分待ってから、針を抜き取り、定位固定から取り除いてください。 少量のin vivo生体適合性透明エラストマー接着剤を二重バレルシリンジから混合する（例えばKwik-Sil）、それと頭蓋骨の穴を覆う。エラストマー接着剤の層の上にシアノアクリレート接着剤を塗布し、硬化させます。 頭皮を縫合し、歩行するまで暖かい回復ケージで動物を麻酔から回復させる。動物をケージに戻す前に、ケトプロフェン（2.5mg / kg）またはカルプロフェン（2.5mg / kg）を皮下投与する。単独で術後の被験者を収容し、手術部位を保護し、24時間後に用量を反復する。 マイクロシリンジを取り外した後、26 Gと35 Gのニードルを蒸留水で7〜10回洗い流して保存してください。 3.プリズムプローブインプラント手術 1-2週間のウイルス注入後、プリズムプローブ移植手術の準備をします。プリズムプローブを70％エタノールで消毒し、レンズペーパーで拭いてください。プリズムプローブをレンズホルダーツールに挿入し、ドライバーで六角ネジを締めます。ベースホルダーに顕微鏡を載せます（磁石がその場所に保持されます）。 術前準備セクションに記載されているように動物を準備する。 目と耳の間で動物の頭をトリミングして剃り、70％エタノールとベタジンの交互スワブで皮膚を消毒する。 滅菌はさみで皮膚を切開し、皮膚のフラップと根底にある骨膜を除去して頭蓋骨を露出させる。綿棒で頭蓋骨を乾かし磨きます。周囲の筋肉組織を十分に除去して、清潔で乾燥した広範囲の骨基盤を作り、次のステップに備える。 反対側の半球の頭蓋骨のネジをインプラントを安定して固定するためにインプラントします。これらは、セクション5の実験的画像撮影セッションのために動物を準備するために目覚め頭部固定のためのヘッドバーを植え込むことを選択する場合にも有用であり得る。 頭蓋骨を水平にし、レンズ挿入のためのAPおよびML座標をマーカマークで示します。マイクロドリル上に0.5mmのバリを使用して、円形の開頭術を行い、e craniotomyの直径は、プリズムの直径、この場合は1.0 mmよりもちょうど大きいです。断続的に中断しながら穏やかに穿孔し、滅菌PBSで頭蓋骨を洗い流し、綿棒で吸い取ります。生成された骨の埃を取り除く。 重要なステップ：プリズムが皮質に挿入されたときに、その平坦な端部（イメージング表面）がウイルス注入部位に面し、150〜200μmの半径内にあるように、開頭術を行う。 頭蓋骨が完全に薄くなる前に掘削を停止してください。血管は、間引かれた骨を通して見ることができます。細かい45°の鉗子で穏やかに骨のプラグを取り外します。 ＃5鉗子で硬膜を削除します。 クリティカルステップ：脳組織が露出したら、常に組織を湿らせてください。 craniotomy上の滅菌生理食塩水に浸した綿棒を置きます。これにより、組織への圧力も維持されます。 脳組織duの圧力を軽減するためにプリズムプローブのリングを挿入すると、事前に挿入領域が作成されます。定位装置の電極ホルダーアームに直線状の解剖ナイフを取り付け、ナイフブレードが頭蓋骨の湾曲に対して垂直である角度（この場合、10°の角度）で、定位装置の電極ホルダアームにウイルス注入カラムに平行な面である。 刃先を腹側に向けて（ 図1 ）、ウイルスの注射部位の側方〜200μmの側方に、その内側前縁に沿って開頭術の上にナイフを注意深く配置する。ナイフ先端がピーアに触れてZ軸をゼロにし、プリズムプローブが挿入される深さまで徐々に（10μm/ s単位で）下げます。その後、ナイフを1mm後方に動かして、プリズムの前縁のための経路を作ります。滅菌前の生理食塩水で切開している間に起こる可能性のある出血を一時停止し、制御する。 <li>ナイフがこの位置に来たら、滅菌生理食塩水でその部位を洗い流し、出血が治まるまで待つ。その後、定位腕のマイクロマニピュレーターを用いて10μm/ s単位で徐々にナイフを引っ込め、切開部の滅菌生理食塩水に浸したゲルフォームスポンジを置く。 レンズホルダー（プリズムプローブと顕微鏡付き）を前のステップでナイフと同じ角度で定位マニピュレーターアームに取り付けます。プリズムの平坦な側面が切開部の上にあり、ウイルス注入カラムに平行になるように、プリズムを整列させる。このステップでは、定位腕の位置を微調整する必要があります。より速い結果を得るために、頭蓋骨の近くに留まることによって調整を調整してください。 プリズムが正しい角度になったら、脳表面から開始して、このプローブの最終zが1.1mmになるように、脳内で10μmずつ徐々に低下させる。脳組織はプリズムの周りに広がり、作成される圧力は視覚の背後にあります視野に影響を与えません。顕微鏡をUSB3ポートを介してインストールされた取得ソフトウェアを備えたコンピュータに接続し、LEDを点灯させて蛍光を視覚化します。 25Gの針を使用して、エラストマー接着剤の非常に薄い保護層で、開頭術のプリズム周辺の露出した組織を覆います。 エラストマー接着剤を硬化させた後（通常約3〜5分）、25G針を使用してシアノアクリレート接着剤を塗布してプリズムレンズのガラスを隣接する頭蓋骨にエラストマー接着剤の層上に取り付け、開腹手術。より良い接着のためにプリズムプローブカフの端を含めてください。埋め込まれたプリズムプローブの上面に接着剤をつかないでください。シアノアクリレート接着剤が硬化したら、レンズホルダーのネジを緩め、顕微鏡を慎重に取り外します。次に、定位固定マニピュレータアームをゆっくりと後退させ、プリズムプローブをしっかりと埋め込んだままにします。 歯科用アクリルまたは周囲の収縮した筋肉組織に接触するまで、全ての露出した頭蓋骨表面を覆うために、インプラント周囲のシアノアクリレート接着剤を除去する。この頭蓋骨キャップで頭蓋骨の広い領域をカバーすると、後にベースプレートの取り付けに役立ちます。インプラント部位周辺の皮膚は、頭蓋骨のまわりでそれ自身で治癒するはずである。 クリティカルステップ：接着剤を周囲の皮膚や筋肉組織に触れさせたり、頭蓋骨の皮膚に浸透させたりしないでください。そうすると皮膚が刺激され、過剰な傷やインプラントへの損傷の原因となります。 オプション：目を覚ました頭部固定のセットアップを使用して、動物を簡単に麻酔またはスクラッビングするのではなく実験的な撮影セッションで動物のベースプレートに取り付けたり取り外したりしたい場合は、選択肢の固定設定（このプロトコルでは実証されていません）。 触媒と塩基をシリコンから混合する。e接着シリンジを使用し、エラストマーの液滴をプリズムプローブカフの内側に入れて、プローブレンズの上部を覆い、損傷や埃の沈降を防ぎます。 定位フレームから動物を取り出し、暖かいチャンバーで麻酔から回復させる。皮下にケトプロフェン（2.5mg / kg）またはカルプロフェン（2.5mg / kg）を投与し、移動したらきれいなホームケージに戻します。インプラントを保護するためにすべての被験者を単独で収容し、24時間後にその投与量を繰り返す。 4.ミニチュア顕微鏡設置用ベースプレートアタッチメントプリズムプローブを移植してから1〜10日後に、移植されたプリズムプローブを介して組織内のウイルス発現をチェックし、調製物が細胞活性を示す場合、ベースプレートを頭蓋骨に取り付ける。顕微鏡は、ライブイメージング中にベースプレート上にドッキングします。 ベースプレートの取り付けのために動物を準備するための術前手順に記載されている手順に従ってください。 移植されたプリズムプローブレンズ上部の表面上にシリコーン接着剤キャップを取り除きます。レンズプローブの表面を調べ、レンズペーパーと70％エタノールで埃を清潔に除去し、イメージング表面がきれいであることを確認します。 顕微鏡をDAQボックスに接続し、USB3ポートを介してPCに接続します。 コンピュータ上の取得ソフトウェアを開き、顕微鏡をUSB3ポート経由で接続します。神経活動をチェックするため、およびこの被験者の将来の記録の視野設定を測定および文書化するために、収集ソフトウェアを使用する。 顕微鏡にベースプレートを取り付け、ベースプレートセットスクリューを固定してベースプレートを所定の位置に保持し、顕微鏡の本体によって定位マイクロマニピュレーターアーム上の顕微鏡グリッパーに顕微鏡を固定する。定位置マイクロマニピュレーターアームに取り付けることができるニューポートロッドにグリッパーを取り付けます。 sを使用してプリズムプローブレンズの上に顕微鏡を置きますtereotaxicマイクロマニピュレーターアーム。視覚的には、動物のステージの側面と背面からプリズムレンズを見て向きを点検します。顕微鏡用対物レンズとプリズムプローブレンズの両方の光軸は一致させなければなりません。 ソフトウェアを通して顕微鏡LEDを点灯させます。取得ソフトウェアの移植されたプリズムプローブレンズの上面に焦点を合わせることによって、顕微鏡の位置合わせの品質を評価します。適切に位置合わせされたとき、プリズムプローブレンズの上面のエッジは鋭くすべきである。 stereotaxicマニピュレータアームを使用して、移植されたプリズムプローブの上の顕微鏡の物理的距離を調整し、組織内の所望の焦点面を得る。顕微鏡対物レンズと移植されたGRINレンズとの間の光学的に最適化された距離は約500μmである。 所望のイメージング平面が捕捉されると、参照蛍光イメージを保存する。 重要な点：顕微鏡の位置を調整しないでください。顕微鏡の位置が変わるため、顕微鏡の位置を調整しないでください。組織内の結像面のオンとなる。 注：次のステップで接着剤を塗布して、ベースプレートの位置を頭蓋に固定します。接着剤は、次の1日または2日にいくらかの体積収縮を経験する可能性があり、これは組織内の焦点面を変える可能性がある。接着剤塗布工程に進む前に、接着剤混合物および生体外距離の収縮量を測定し、顕微鏡+ベースプレートの最終Z位置をその量だけバックアップすることによって、これを事前に考慮する。 歯科アクリルまたはシアノアクリレートを使用して、動物の頭蓋骨を覆っているアクリルキャップにベースプレートを恒久的に取り付け、アクリルまたは接着剤との隙間を橋渡しします。歯科用アクリル/シアノアクリレートを徐々に塗布し、多段階で硬化させることにより、前述の収縮が顕微鏡の画像面の最終位置に及ぼす影響を最小限に抑えることができる。 クリティカルステップ：歯科治療中に注意してくださいアクリル/シアノアクリレートを使用して、顕微鏡の対物レンズ、セットスクリュー、または顕微鏡本体に物質が接触するのを防ぎます。これにより、後で計測器が正しく動作しなくなります。 クリティカルステップ：接着剤を塗布しながら、顕微鏡を押す必要はありません。顕微鏡またはベースプレートに対する圧力は、プリズムプローブレンズに対する顕微鏡対物レンズの動きを引き起こし、その結果、ミスアライメントまたは迅速な再調整を必要とする組織内の焦点面の変化が生じる可能性がある。 歯科用アクリル/シアノアクリレートが、一対の鉗子またはシリンジ先端でアクリルを叩くことによって硬化し、硬化したことを確認する。取得ソフトウェアで最終参照蛍光画像を取得する。 グリッパから顕微鏡を離し、グリッパを顕微鏡から引き抜きます。シアノアクリレートなどの透明接着剤を使用した場合は、黒いマニキュアまたは黒色の歯科用セメントの層で覆い、実験中に得られた将来の画像を汚染する可能性のあるヘッドキャップ内への軽い光漏れ。 この時点で、必要に応じて顕微鏡を取り外します。顕微鏡をベースプレートから分離するには、セットスクリューを反時計回りに約1/2回転させてベースプレートセットスクリューを外します。もう一方の手でベースプレートとアクリルキャップを支えながら顕微鏡本体を挟み、顕微鏡をまっすぐ引き上げます。保管容器に入れ替えます。 移植されたプリズムプローブをベースプレートカバーで保護します。これによりレンズ表面に塵埃が付着するのを防ぎます。ベースプレートを取り付けた後はきれいにすることができます。 ベースプレートカバーをベースプレートに取り付け、セットスクリューを時計回りに約1/2回転させるか、またはセットスクリューがベースプレートカバーと同じ高さになるまで進めます。過度にしないでください。 動物を麻酔から取り除き、歩行するまで暖かい回復チャンバーでモニターする。戻るその家の檻へインプラントを保護するために、移植されたベースプレートですべての動物を単独で収容します。 自由に動くマウスに複数の皮質層を画像化する行動装置（ 例えば、 Phenotyper、Noldus）を洗浄して消毒し、10％漂白剤溶液で拭いて準備する。 顕微鏡をDAQボックスに差し込み、コンピュータに接続し、収集ソフトウェアを起動します。 収集コンピュータ上の十分なファイルストレージスペースを確認し、カルシウムイメージングムービー用のスペースを確保します。顕微鏡とコンピュータの間の高いデータ転送速度に対応し、記録中にデータが失われないように、外付けハードドライブに書き込むのではなく、ソフトウェアからローカルハードディスクに直接保存します。 顕微鏡を取り付けるために誘導チャンバー内でイソフルラン（酸素中5％）で動物を麻酔する。あるいは、動物を静かにこすったり、目を覚まされた頭に固定された設定麻酔が選択された行動パラダイムを妨害することがわかっている場合には、頭部を持ってください。 ベースプレートの止めねじを反時計回りに回し、ベースプレートのカバーを持ち上げて、ベースプレートのカバーを取り外します。 顕微鏡のベースプレートを動物の上に置きます。顕微鏡はベースプレート上の磁石の助けを借りて所定の位置にはめ込まれるべきです。わずかな抵抗が感じられるまでベースプレートセットスクリューを前進させます。 重要なステップ：ベースプレートの固定ネジを締めすぎないようにして、顕微鏡ハウジングが損傷しないようにします。 ソフトウェアで蛍光スナップショットを取得し、必要に応じて顕微鏡のタレットセットのネジを緩めて顕微鏡のタレットを回転させて細かい焦点を調整し、次にタレットを締め直して組織内の焦点面を調整して組織内のイメージング面を確認しますハウジングセットスクリュー。 クリティカルステップ：最初にセットスクリューを緩めることなくタレットを回転させないでください。タレットセットネジを締めすぎないでください。 縦方向の調査を行う場合は、物理的なタレット位置に戻り、同じ視野をキャプチャします。ハードウェアでは、同じ視野に素早く戻るために同じ顕微鏡で撮影された各動物について、タレットの回転数またはタレットの物理的位置を記録します。 顕微鏡を携行している動物をホームケージまたは行動室に放出して適応させ、適用可能であれば麻酔の消耗を待つ。 クリティカルステップ：実験セッションを開始する前に、顕微鏡を身に着けて正常動作を妨げないようにするまで、ダミー顕微鏡を使用して、いくつかのセッションのために顕微鏡の重量を運ぶように動物を訓練する。目まぐるしい拘束のための通常の取り扱いと訓練は動物に過度のストレスを与えないようにする。 データ収集に使用する取得設定を選択します。これには、私はデータをキャプチャするためのレート（ たとえば、 20 fps、ゲイン1、LEDパワー50％）。良好なSNRを保証するために設定を選択するときは、画像ヒストグラムを確認してください。 注：蛍光収集の開口数は、1mmのプリズムプローブでは0.35であり、1mmの直線プローブでは0.5であるのに対して、0.35である。 ビヘイビアソフトウェアを起動し、所望のイメージング記録サイクル（ 例えば 、4×5分ON 2分OFF）で顕微鏡をトリガーするようプログラムする。 Noldus IOボックスのTTLポートをRJ45-BNCケーブルを介してDAQボックスのTRIGポートに接続します。 まだそこにいなければ、動物を行動場に置き、実験を始める。 所望のデータを取得した後、誘導チャンバ内でイソフルラン（酸素中5％）で動物を再麻酔するか、または動物を静かに覚醒させる。 ベースプレートセットのネジを緩め、顕微鏡を静かに引き上げてベースプレートから顕微鏡を取り外します。ベースプレートカバーを取り付け、ベースプレートを静かに締めますセットスクリュー。 次回の記録まで動物をホームケージに戻してください。後続の画像化セッションを同じ視野に戻すための基準として、参照蛍光画像を使用する。 6.大規模なCa 2+イメージングデータの評価視野内の細胞位置およびCa 2+動態をデータから抽出するために、異なるデータ解析プラットフォームを使用することができる。大規模なCa 2+イメージングムービーを処理するために特別に設計されたデータ解析プラットフォームであるMosaicは、ここでこの研究に使用されています。 不良ピクセルを修正し、前処理ステップで生のムービー内にドロップされた個々のフレームを補間します。スペース1,440 x 1,080ピクセルの視野から720 x 540ピクセルまで画像をビンして、データフットプリントを削減します。 顕微鏡のイメージセンサーに関する脳のモーションアーチファクトを補正するには、厳密なImageJベースのイメージを使用してムービーを登録しますgistrationアルゴリズム（TurboReg）。 個々のニューロンを同定するために、蛍光の相対的変化として画像を再表現する。ΔF/ F 0 = FF 0 / F 0ここで、F 0は映画全体を平均して得られる平均画像である。 確立されたセルソートアルゴリズムを使用して、個々のセルに対応する空間フィルタを識別します。ここでは、個々のニューロンを識別するためにプリンシパルおよび個別コンポーネント分析21を使用しました。 注記：トレース中のイベントのピーク振幅が、データセットのトレースのベースラインから8標準偏差を超えており、細胞位置およびCa 2+動態データをさらなる分析のためにエクスポートした場合、イベントが指定されました。