リコンビナーゼ媒介カセット交換を用いて、マウス胚性幹細胞における構造と機能の研究

哺乳動物のゲノムは、約20,000のタンパク質をコードする遺伝子が含まれていると推定されています。選択的スプライシングと翻訳後修飾は、さらに、タンパク質のレパートリーを増やします。タンパク質は、モジュラー構造^1を有し、しばしば、異なるタンパク質複合体へのそれらの動員および複数の細胞プロセス²への参加を可能にする、複数の相互作用ドメインを含みます。一つの例は、p120ctnと呼ばれる多機能性タンパク質です。 p120ctnはCtnnd1遺伝子によってコードされ、N末端およびC末端領域によって隣接大きな中央アルマジロリピートドメインから構成されています。 p120ctnのアルマジロドメインは、細胞 – 細胞接着に関与している古典的カドヘリンの高度に保存された膜近傍ドメインに結合し、それはまた、転写リプレッサーKaisoに結合します。 p120ctnのN末端ドメインは、異なるキナーゼ、ホスファターゼ、小さなRhoGTPases、及び微小管関連Pと相互作用しますroteins ^3。興味深いことに、選択的スプライシングの結果として、p120ctnアイソフォームは、4つの代替開始コドン⁴から生成することができます。それは最も5' 開始コドンから翻訳および全長N末端セグメントを含むようp120ctnアイソフォーム1Aは、最長です。 p120ctnアイソフォーム3および図4に、このN末端セグメントは、それぞれ、部分的におよび完全に削除されます。さまざまな細胞機能におけるタンパク質（またはタンパク質アイソフォーム）とそのドメインの正確な役割を理解することが課題です。

たmESCにおいて標的遺伝子は、対応する遺伝子の遺伝子欠失を介してタンパク質の機能の研究を可能にし、広く発達重要と疾患関連遺伝子および経路の同定に貢献しています。逆遺伝学では、この画期的なによる相同組換え⁵にMESC単離及び標的遺伝子の分野における進歩の結果でした</s>アップ。相同組換えは、DNAフラグメントが二本鎖（ds）DNA切断後に2つの類似または同一の核酸部分との間で交換されるプロセスです。二本鎖DNA切断が頻繁であるため、通常、HRは非効率的です。最近、標的相同性指向性遺伝子の効率は、部位特異的ヌクレアーゼ^6,7を用いて増加させることができるが、残念ながら、これらは、オフターゲット効果⁸を受けやすいです。遺伝子ターゲティングを可能にするためのより信頼性の高い技術は、のCre / loxP配列又はFLPe / FRTなどの部位特異的組換え系に基づいているRMCE、です。 LoxP及びFRT配列は、 バクテリオファージP1で発見され、 サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は 、それぞれ、サイトの向きを決定非対称8塩基対の配列を含む、34塩基対から成ります。例えば、DNAストレッチ内の2つのloxP部位は、flox化DNAを切除またはIとなるかどうかを決定する一方、配向のCre媒介組み換え⁹時nversed。二つの部位が異なる染色体上に位置している場合また、Creをも転位を誘導することができます。 RMCEは、クロス反応し、ゲノム遺伝子座に埋め込まれていない異種の組換え部位を利用しています。同じ異種部位に隣接するDNA断片を含有するドナープラスミドの存在下で、リコンビナーゼは、なぜなら、二重同時トランスロケーション（ 図1）のRMCE互換ゲノム遺伝子座にこのDNA断片を挿入します。ここで、のみ正しくRMCE標的クローンをドッキング細胞のR26ゲノム中に存在する「捕捉された、」プロモーターレスネオマイシン耐性遺伝子（ネオ^R）を復元着信ベクター上のプロモーター（ 図1）に対する薬剤耐性のおかげをレンダリングすることができ^10、11。これは^、<100％11しばしば近く、非常に高いターゲティング効率をもたらします/ SUP> ^12。結論として、RMCEベースのターゲティングは非常に効率的であり、構造機能研究のために使用することができます。しかし、それは事前設計ゲノム遺伝子座を必要とします。

図1. RMCE媒介ターゲティングの略図。両方は、2つの異種FRT部位（白及び赤の三角形によって示される）を保有する場合RMCEは、定義されたゲノム遺伝子座への着信ターゲティングベクターからのDNAセグメントの交換を可能にします。加えて、操作されたゲノム遺伝子座は、プロモーターおよび短縮型ネオマイシン耐性（ネオ^R）遺伝子を含みます。プロモーターを提供することによってのみ正しい組換え事象は、高いターゲティング効率で得られ、ネオマイシン耐性を復元する、入ってくるDNA断片に開始コドン。 トンの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。彼のフィギュア。

たmESCにおけるゲノム工学は、RMCE互換マウスの生成を可能にします。 1981年に、2つのグループが胚盤胞の内部細胞塊（ICM）から多能性細胞を捕捉及び培養^13、14でそれらを維持することに成功しました。たmESCは、生殖細胞系列を含む、胚および成人の細胞のすべてのタイプの中に自己複製と分化することができます。したがって、たmESCにおいて標的遺伝子（のCre / loxPシステムを使用して）構成的または条件付きKOマウスの開発を通して逆遺伝学的研究を可能にします。しかし、マウスES細胞を分離するための古典的な方法は非常に非効率的です。いくつかの主要な改良が大幅MESC SRとウシ胎児血清^{（FBS）16を}含有する培地、及び薬理学の使用の間に交互に^、15培地（SR）に定義血清置換の使用を含む、MESCラインを導出するための成功率が増加しています例えばpluripotin又は2I ¹⁷などの論理化合物。 Pluripotin、小さな合成分子は、白血病阻害因子（LIF）およびマウス胚線維芽細胞（MEFの^）18の非存在下で未分化状態におけるたmESCの伝播を可能にします。最後に、SR / FBS培地交替プロトコルはLIFと^19、20 pluripotin組み合わせた場合たmESCは（100％に近い）非常に高い効率で単離することができることが示されています。これらのプロトコルは、その後、構造 – 機能研究のために使用することができるRMCE互換ノックアウトたmESCの効率的な分離を可能にします。

本論文では、特定の細胞プロセスに責任があるタンパク質内のキーのドメインまたは残基を同定するために、1つを可能にする方法を説明します。この目的のために、効率的MESC分離を有効に高度な技術、ターゲティングベクターのアセンブリ、およびMESCターゲティングのパイプラインを作成しましたD。このようにして、タンパク質アイソフォーム、ドメイン変異体、および下流のエフェクターとの大きなパネルがKOされたmESCで導入することができ、in vitroでの KO表現型を救出する能力について評価することができます。