형광 기반의 뉴 라미니다 아제 억제 분석은 항 바이러스제의 뉴 라미니다 아제 억제제 클래스에 인플루엔자 바이러스의 감수성을 평가하기 위해

1. 결정 형광 분석기에 형광 제품 4-MU의 선형 범위 무수 에탄올 5 mL에 4- MU 11.3 mg을 용해시켜 6.4 mM의 4-MU 스톡 용액 10 ㎖를 준비한다. (V / W) 원액 10 mL로 0.9 % 염화나트륨 5 mL를 추가합니다. 9 ㎖의 1X의 분석 완충액 (33.3 mM의 2- (N- 모르 폴리 노) 에탄 술폰산 (MES) 및 4 mM의 CaCl2를, pH가 6.5)에 6.4 mM의 4-MU 1 mL로 희석 한 용액을 작업 640 μM을 준비한다. 주 : MES 13 g 및 증류수 8㎖를 1 M 염화칼슘 2 992 ㎖를 첨가하여 2 배의 분석 완충액을 준비한다. M의 NaOH (10)를 사용하여 6.5로 pH를 조정한다. 기공 크기 0.2 ㎛의 멸균 된 셀룰로오스 아세테이트 필터를 사용하여 상기 버퍼 필터. 주의! 수산화 나트륨 가성이며, 피부와 눈에 화학적 화상을 입을 수 있습니다. 그 전체 개인 보호 장비를 착용 있는지 확인하십시오. MU-4 농도 (즉, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 #의 범위 5 ㎖를 준비181; M, 및 1X 검정 완충액을 사용하여 640 μM 4-MU의 2 배 일련 희석액 내지 320 μM). 4-MU (즉, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM, 320 μM 및 640 μM) 맑고로 (희석 당 두 개의 웰), 96의 각각의 일련 희석액 50 μL 분주 웰 평면 바닥 플레이트 (바탕 신호를 측정하는 역할을 공백) 나머지 웰에 1X 검정 완충액 50 μL. 주 : 반응 부피 4-MU의 최종 농도 (50 μL 4-MU + 50 μL 300 μM의 MUNANA)가 160 μM, 320 μM 2.5 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM이다 . 증류수 20㎖에 MUNANA 25 mg의 재구성하여 MUNANA 2.5mM의 원액을 준비한다. 300 μM의 MUNANA 작업 용액 (한 접시에 충분한 양)을 얻었다 5.28 ㎖의 1X 검정 완충액 중 2.5 맹 무나나 0.72 mL를 섞는다. 300 μM의 MUNANA의 일하는를 포함하는 튜브를 커버즉시 사용하지 않는 g의 알루미늄 호일로 용액을 얼음에 보관. 남은 재료를 폐기하십시오. 참고 : 2.5 밀리미터 MUNANA 주식 솔루션 1 달 동안 -20 ° C에서 저장 될 수있는 한 동결 / 해동 사이클 내에서 사용되어야합니다. 4-MU와 MUNANA 솔루션은 광 감응성과 장시간 노광으로부터 보호되어야한다. 부드럽게 섞어 탭 각 웰에 300 μM의 MUNANA의 50 μL를 추가하고, 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 증발을 방지하기 위해 판 실러와 함께 접시를 커버. 주의 :이 단계는 NA 억제 분석에서의 형광 배경을 설명한다. 0.824 M의 NaOH 2.225 ㎖ (하나의 판에 충분한 양)을 무수 에탄올 11 mL를 혼합하여 정지 용액을 준비한다. 반응을 중지하고 부드럽게 섞어 활용할 각 웰에 스톱 솔루션의 100 μL를 추가합니다. PE로서, 여기 파장 355 ㎚, 설정의 460 nm의 발광 파장을 갖는 형광 설정을 사용하여 플레이트를 판독제조업체의 지침을 r에. 어떠한 4-MU를 포함하지 않는 모든 웰에서 형광 신호를 사용하여, 평균 배경 신호를 계산한다. MU-4를 함유하는 각각의 웰로부터 배경이 평균 신호를 뺀 각 MU-4 농도의 평균 신호 (RFU)를 계산한다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, MU-4 농도 (μM)의 RFU에 대하여 표준 곡선을 플롯; 곡선의 근접 선형 부분은도 1b에 도시된다. 선형 범위 및 최적 목표 신호를 결정하기 위해 MU-4 농도 (μM) 대 RFU의 플롯을 시각화; 선형 범위는 어디 플롯 4-MU의 농도 증가에 비례하여 형광 신호가 증가함에 따라, 최적의 목표 신호는 선형 범위 내의 임의의 4-MU 농도된다. 주 : 선형 범위 및 최적의 목표 신호는 형광 특정한다. 예를 들어, 멜버른 WHOCCRRI에서 형광은 2의 선형 범위를 갖는다0.5-40 μM 4-MU와 1,500 ~ RFU에 대응 ~ 30 μM 4-MU의 최적 목표 신호. 2. 바이러스의 NA 활동 결정 참고 : 인플루엔자 바이러스는 Madin-다비 개 신장 (MDCK) 세포 또는 발육 계란 8에서 충분한 역가을 배양한다. 0.1 %를 함유하는 컬럼에 희석 한 배양 된 인플루엔자 바이러스의 웰 당 120 μL 및 1X 검정 완충액 60 μL 분주 NP-40, 96 웰, U-바닥 판 (11)의 남은 열로. 직렬로 플레이트를 통해 바이러스의 두 배 희석을 수행하는 (즉, 2 열의 컬럼 1 내지 60 μL를 전송하는 등, 열 (11)까지) 만 1X 검정 완충액을 함유하는 블랭크로서 컬럼 (12)을두고, 멀티 채널 피펫을 사용. 맑은 96 웰 편평 바닥 플레이트에 웰 (희석 바이러스 블랭크)로부터 각각 50 μL를 옮긴다. 참고 : C에 필요하지 않습니다물질은 제 1 열로 통해 컬럼 (12)로부터 전송되는 경우 hange 피펫 팁. 웰 당 (단계 1.4에 따라 제조 됨) 300 μM MUNANA 50 μL를 첨가하고 부드럽게 혼합 할 수있는 플레이트를 탭. 1 시간 동안 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. 증발을 방지하기 위해 판 실러와 함께 접시를 커버. 반응을 종결하고 부드럽게 혼합 판은 탭하여 웰 당 (단계 1.6에 따라 제조 됨)을 정지 용액 100 μL를 추가한다. 형광 분석기를 사용하여 판을 읽어보십시오. 여기 파장 355 ㎚, 설정의 460 nm의 발광 파장 설정을 사용한다. 컬럼 (12)에서의 형광 판독 값에 기초하여, 평균 배경 신호를 결정하고, 각 웰의 평균 배경 신호를 감산. 바이러스 희석에 대한 RFU의 그래프를 그린다. 주 : WHOCCRRI 멜버른 100 μM의 MUNANA의 배경 값은 50과 120 사이 RFU 일반적이지만, 이들은 형광의 BEI 따라 다르고NG 사용. 각 바이러스 (그림 2)에 대한 곡선의 선형 부분의 중간 지점을 결정하는 바이러스 희석에 대한 RFU의 줄거리를 볼 수 있습니다. 기준점으로서 (1 단계에서 결정됨) 최적 목표 신호를 사용한다. 주 :이 제 1 항에서 결정된 형광의 4-MU 선형 범위와 일치해야 바이러스의 적정 농도는 (3)에서 사용되는 제공한다. 3. NA 억제 분석을 사용하여 NA 억제제에 바이러스 감수성을 평가 300 μM의 농도 NA 억제제의 마스터 재고를 준비한다. 2 × 50 ㎖의 분석 완충액 (66.6 mM의 MES의 8 mM의 CaCl2를, pH가 6.5) 나미 비르 5.0 ㎎을 용해시켜 300 μM 나미 비르 (분자량 MW = 332.32 g / 몰)을 준비한다. 배 검정 완충액 50ml에 5.8 ㎎을 용해 (MW = 386.44 g / 몰 D 타르트 레이트) 300 μM 오셀 카르복시산을 준비한다. 준비300 μM peramivir 삼수화물 (MW = 382.45 g / mol)의 2 배 검정 완충액 50 ml에 5.7 mg의 용해. 배 검정 완충액 50ml에 5.2 mg을 용해시켜 300 μM laninamivir (MW = 346.34 g / 몰)을 준비한다. 주 : NA 억제제 마스터 주식 12 개월 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 정확한 무게와 볼륨 재구성에 사용되는 보장하기 위해 NA 억제제의 MW를 확인합니다. 오셀 카르복시산은 전구 약물 오셀 타미 비르 포스페이트의 활성 화합물이다. 따라서, 단지 오셀 카르복시산은 NA 억제 분석에 사용한다. 마스터 주식에서 0.03 nM 내지 0.3 nM의 3 nM 내지 30 nM 내지 300 nM 내지 3,000 nM의 농도에서 50 mL의 원심 분리 튜브 내의 NA 억제제의 10 배 희석액의 주식을 작동 준비하고 배 분석 30,000 nM 내지 버퍼 (66.6 mM의 MES의 8 mM의 CaCl2를, pH가 6.5); 이 여러 분석에서 사용할 수 있습니다. 비고 : 반응에 있습니다 volum NA 억제제의 최종 농도E (바이러스 희석액 300 μM의 MUNANA의 + 50 μL NA의 억제제 + 50 μL의 50 μL)을 각각 0.01 nM 내지 0.1 nM 내지 1 nM 내지 10 nM 내지 100 nM 내지 1,000 nM의, 및 10000 나노 미터이다. 최종 농도는 스톱 솔루션의 100 μL를 포함하지 않습니다. 2-8 ° C에서 모든 NA 억제제의 희석을 저장합니다. 유통 기한은 마스터 주식과 동일합니다. 96 딥 – 웰 블록, 0.1 % NP-40 계면 활성제를 함유하는 1X 검정 완충액에 희석 바이러스를 준비한다. 네 NA 억제제 테스트 바이러스 당 2ml의 총 부피를 사용하여 섹션 (2)로부터 유도되는 NA 활성 분석 결과에 기초하여 바이러스를 희석하여 사용한다. 참고 : 96 깊은 우물 블록에 바이러스 당 두 개의 우물 (물론 당 1 mL로) 준비합니다. VIRUS 1, 2 및 3에 대한 바이러스 희석액의 예는 표 1에 나타내었다. 8 깊은 웰에 저장한다 (단계 3.2에 따라 제조 됨) NA 억제제의 필요한 양을 분배. 여기에서, 레인 징 희석액 50 μL NA 저해제 분배이 0 ㎚ (2 × 시험 B로부터uffer 만) 맑은 96 웰 편평 바닥 플레이트에서 H로 행 A의 nM 내지 30,000이다. 주 : 플레이트 레이아웃이도 3에 도시되어있다. 부드럽게 혼합하고 45 분 동안 실온에서 배양 접시를 탭에만 열 (12)에 열 1-11 및 1X 검정 완충액의 웰 당 50 μL로 희석하여 웰 당 시험 바이러스의 50 μL를 추가한다. 증발을 방지하기 위해 판 실러와 함께 접시를 커버. 웰 당 (단계 1.4에 따라 제조 됨) 300 μM MUNANA 50 μL를 첨가하고 부드럽게 혼합 할 수있는 플레이트를 탭. 1 시간 동안 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. 증발을 방지하기 위해 판 실러와 함께 접시를 커버. 믹싱 플레이트를 부드럽게 눌러 웰 각각 (단계 1.6에 따라 제조 됨)을 정지 용액 100 μL를 추가한다. 형광 분석기를 사용하여 판을 읽어보십시오. 전술 한 바와 같이, 여기 파장 355 ㎚, 460 나노 미터의 방출 파장을 사용한다. 4. 계산IC 50 값 주 : JASPR 1.2가 IC (50) 값의 계산을 가능 곡선 피팅 소프트웨어이다. 소프트웨어는 CDC, 애틀랜타, 미국에서 인플루엔자 부문에 의해 개발되었다. 소프트웨어는 방정식을 활용 : V = V 맥스 × (1 – ([I]는 [I]는)) / (K i가 +), V 최대 대사의 최대 레이트이다은 [I]을, V는 억제제의 농도이다 반응이 억제되고, 및 K의 난 억제 곡선에 대한 IC (50)이다. 복사 및 12 열 플레이트 포맷 (96 웰)에 스프레드 시트로 형광에 의해 출력 된 원시 데이터를 붙여, 전지 A1부터 시작. 참고 : 각 후속 판에서 원시 데이터는 하나의 빈 행에 의해 비틀 거렸다해야합니다. 각각의 바이러스는 네 NA 억제제에 대해 테스트 된 경우 (각 판 사이의 빈 행으로) 네 세트의 원시 데이터를 붙여. 피팅 소프트웨어 및 CL을 엽니 다'실험'탭에서 ICK. "대안이 약물 불소 (11) 샘플 '을 선택합니다. "옵션"탭을 클릭하고 체크 "그래프를 생성합니다." "옵션"을 다시 클릭하고 "새 키"탭을 클릭합니다. 원시 데이터 스프레드 시트 파일과 같은 폴더에있는 "inhibition_key".csv 파일을 저장합니다. inhibition_key 파일에서 ID 아래의 모든 샘플 이름을 나열합니다. 각 샘플의 이름은 고유해야합니다. 네 NA 억제제 테스트 한 경우, 오셀 타미 비르 다음 두 행의 추가 공간을 삽입하여 "Peramivir"에서 입력 "을 Laninamivir." inhibition_key 파일에 변경 사항을 저장합니다. 은 "jaspr의 V 1.2 – 억제 곡선 피팅"창으로 돌아가서으로 "실험 파일"과 inhibition_key와 같은 원시 데이터 파일 선택 "키 파일을." 분석을 실행합니다. .CSV과 PDF 파일 (* .pdf)의 결과를 저장합니다. 주 : 소프트웨어가 자동으로 억제 곡선을 그릴 것이다 (RFU 전압 강하NST NA 억제제 농도),도 4에 도시 된 바와 같이. 프로그램은 또한 개별 NA 억제제 (도 4)에 대해 각각의 바이러스에 대한 IC 50 값을 계산한다. 또한 JASPR의 IC 50 값은 스프레드 시트 형식의 신호 대 배경 (S / B)의 비율을 나타낸다. 배경 값은 사용 된 형광에 따라 실험실 실험실에서 다를 수있다. 멜버른 WHOCCRRI에서, 배경은 50 내지 120 RFU 100 μM의 범위 MUNANA 값. 10 미만의 비율은 특히 매우 낮은 NA의 활성을 갖는 돌연변이 바이러스가 여전히 허용되지만 신뢰성 IC 50 값, ≥10의 S / B의 비율이 바람직하다. 이 IC 50 값은 소프트웨어에 의해 생성 된 곡선 형상을 검사한다. 모든 데이터 포인트에 떨어지거나 곡선에 근접한다 그렇지 않은 경우 NA 억제 분석을 반복합니다. 참고 : 비정상적으로 높은 IC (50) 값을 표시 바이러스의 경우, 분석은 반복해야한다에드는 결과를 확인합니다.