Basées sur la fluorescence neuraminidase Essai d'inhibition pour évaluer la sensibilité des virus de la grippe à la neuraminidase Inhibiteur Classe de Antiviraux

1. Détermination de la gamme linéaire du produit fluorescent 4-MU sur un Fluorometer Préparer 10 ml de 6,4 mM de solution mère de 4-MU par dissolution de 11,3 mg de 4-MU dans 5 ml d'éthanol absolu. Ajouter 5 ml de NaCl à 0,9% (p / v) de la solution mère pour faire 10 ml. Préparer une solution 640 uM de travail en diluant 1 ml de 6,4 mM de 4-MU dans 9 ml de tampon de dosage 1x (33,3 mM de 2- (N-morpholino) éthanesulfonique (MES) et 4 mM de CaCl2, pH 6,5). NOTE: Préparer le tampon d'essai 2x en ajoutant 13 g de MES et 8 ml de 1 M CaCl 2 à 992 ml d'eau distillée. Ajuster le pH à 6,5 en utilisant de 10 M de NaOH. Filtrer le tampon en utilisant un filtre d'acétate de cellulose stérile de taille de pores de 0,2 um. Mise en garde! L'hydroxyde de sodium est caustique et peut causer des brûlures chimiques sur la peau et les yeux. Assurez-vous que l'équipement complet de protection individuelle est usée. Préparer 5 ml d'une gamme de concentrations 4-MU ( par exemple, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 & #181; M, et 320 uM) à travers une série de dilutions deux fois de 640 pM 4-MU en utilisant un tampon de dosage 1x. Distribuer 50 uL de chaque dilution en série de 4-MU ( par exemple, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 uM, 320 uM et 640 uM) (deux puits par dilution) dans un cadre clair, 96- puits d'une plaque à fond plat et 50 ul de tampon d'essai 1x dans les puits restants (qui servent de flans pour mesurer des signaux d'arrière-plan). NOTE: Les concentrations finales de 4-MU dans le volume de réaction (50 uL 4-MU + 50 uL 300 uM Muñana) sont de 2,5 pM, 5 pM, 10 pM, 20 pM, 40 pM, 80 pM, 160 pM et 320 pM . Préparer une solution mère 2,5 mM MUNANA en reconstituant 25 mg de Muñana dans 20 ml d'eau distillée. Mélanger 0,72 ml de 2,5 mM MUNANA avec 5,28 mL de tampon de dosage 1x pour obtenir une solution de travail 300 uM Muñana (volume suffisant pour une plaque). Couvrir le tube contenant 300 uM Muñana working de solution avec une feuille d'aluminium et le garder sur la glace à moins utilisé immédiatement. Jetez les restes de matériaux. NOTE: Le 1 mois solution mère 2,5 mM MUNANA peut être conservé à -20 ° C et doit être utilisé dans un cycle de gel / dégel. Les 4-MU et des solutions Muñana sont sensibles à la lumière et doivent être protégés d'une exposition prolongée lumière. Ajouter 50 ul de 300 uM Muñana à chaque puits, appuyez doucement pour mélanger et incuber à 37 ° C pendant 30 min. Couvrir la plaque avec un scellant de plaque pour éviter l'évaporation. REMARQUE: Cette étape est de rendre compte de la fluorescence de fond dans l'essai d'inhibition NA. Préparer la solution d'arrêt par mélange de 11 ml d'éthanol absolu avec 2,225 ml de NaOH 0,824 M (volume suffisant pour une plaque). Ajouter 100 pi de solution d'arrêt à chaque puits pour arrêter la réaction et tapoter doucement pour mélanger. Lire la plaque en utilisant un fluorimètre avec un réglage de longueur d'onde d'excitation de 355 nm et un paramètre de longueur d'onde d'émission de 460 nm, comme per les instructions du fabricant. Calculer le signal d'arrière-plan en utilisant la moyenne des signaux de fluorescence de tous les puits ne contenant pas de 4-MU. Soustraire ce signal de fond moyen dans chacun des puits contenant 4-MU et calculer les signaux moyens (RFU) pour chaque concentration de 4-MU. Tracer la courbe d' étalonnage de la concentration RFU contre 4-MU (uM), comme représenté sur la figure 1a; une section linéaire gros plan de la courbe est représentée sur la figure 1b. Visualiser le tracé de la concentration RFU 4-MU (uM) pour déterminer la plage linéaire et le signal de cible optimal; la plage linéaire est où le signal de fluorescence augmente proportionnellement à la concentration croissante de la 4-MU sur le terrain, tandis que le signal cible optimal est une concentration de 4-MU arbitraire dans la plage linéaire. NOTE: La gamme linéaire et le signal cible optimal sont spécifiques fluorimètre. Par exemple, le fluorimètre à Melbourne WHOCCRRI a une gamme linéaire de 20,5 à 40 uM 4-MU et un signal de cible optimale d'environ 30 pM de 4-MU, qui correspond à ~ 1500 RFU. 2. Détermination de l'activité NA des virus NOTE: Les virus grippaux sont cultivées à des titres suffisants dans des cellules ou des œufs de poule embryonnés 8 Madin-Darby Canine Kidney (MDCK). Distribuer 120 pl par puits de virus de la grippe en culture non dilués dans la colonne 1 et 60 ul de tampon d'essai 1x contenant 0,1% de NP-40 dans les 11 colonnes restantes d'un 96 puits, une plaque à fond en U. Série effectuer une dilution de deux fois des virus à travers la plaque ( par exemple, le transfert de 60 ul de la colonne 1 à la colonne 2 et ainsi de suite, jusqu'à la colonne 11) à l' aide d' une pipette multicanaux, colonne en laissant 12 un vide contenant un tampon d'essai seulement 1x. Transférer 50 ul de chacun des puits (virus dilués et blancs) dans un cadre clair, à 96 puits, une plaque à fond plat. NOTE: Il est nécessaire de cembouts de pipette de hanger si les matériaux sont transférés de la colonne 12 à la colonne 1. Ajouter 50 ul de 300 uM Muñana (préparé selon l'étape 1.4) par puits et tapoter doucement la plaque pour mélanger. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 1 h. Couvrir la plaque avec un scellant de plaque pour éviter l'évaporation. Ajouter 100 ul de solution d'arrêt (préparé selon l'étape 1.6) par puits pour arrêter la réaction et tapoter doucement la plaque pour mélanger. Lire la plaque à l' aide d' un fluorimètre. Utiliser un paramètre de longueur d'onde d'excitation de 355 nm et un paramètre de longueur d'onde d'émission de 460 nm. Déterminer le signal de fond moyen sur la base des lectures de fluorescence dans la colonne 12 et soustraire le signal d'arrière-plan moyenne de chaque puits. Tracer un graphique de RFU contre des dilutions de virus. NOTE: Les valeurs de base pour 100 uM Munana au WHOCCRRI Melbourne se situent généralement entre 50 et 120 RFU, mais ceux-ci diffèrent en fonction du fluorimètre being utilisé. Voir l'intrigue de RFU contre des dilutions de virus pour déterminer le point médian de la section linéaire de la courbe pour chaque virus (figure 2). Utiliser le signal de cible optimale (déterminée à l'étape 1) en tant que point de référence. NOTE: Cela devrait correspondre à la plage linéaire 4-MU du fluorimètre déterminé à l'article 1 et fournira la concentration appropriée de virus à utiliser dans la section 3. 3. Évaluation de virus Susceptibilité aux inhibiteurs de NA NA Utilisation du Test d'inhibition Préparer les stocks de base des inhibiteurs de NA à des concentrations de 300 uM. Préparer 300 uM zanamivir (poids moléculaire, PM = 332,32 g / mol) en dissolvant 5,0 mg de zanamivir dans 50 ml de tampon d'essai 2x (66,6 mM de MES et 8 mM de CaCl2, pH 6,5). Préparer 300 uM carboxylate d'oseltamivir (D-tartrate; PM = 386,44 g / mol) par dissolution de 5,8 mg dans 50 ml de tampon d'essai 2x. Préparer300 uM de trihydrate d'Peramivir (PM = 382,45 g / mol) par dissolution de 5,7 mg dans 50 ml de tampon d'essai 2x. Préparer 300 uM Laninamivir (PM = 346,34 g / mol) par dissolution de 5,2 mg dans 50 ml de tampon d'essai 2x. REMARQUE: Les stocks de base d'inhibiteurs de NA peuvent être conservés à -20 ° C pendant 12 mois. Vérifier la MW des inhibiteurs de NA pour assurer les poids et les volumes corrects sont utilisés dans la reconstitution. Le carboxylate d'oseltamivir est le composé actif du phosphate d'oseltamivir de promédicament. Par conséquent, seul le carboxylate d'oseltamivir doit être utilisé dans le test d'inhibition NA. A partir des valeurs de base, de préparer des stocks de travail de dilutions en série de dix fois des inhibiteurs de NA dans des tubes de centrifugation de 50 ml à des concentrations de 0,03 nM, 0,3 nM, 3 nM, 30 nM, 300 nM, 3000 nM et 30 000 nM dans l'essai 2x tampon MES (66,6 mM et 8 mM de CaCl2, pH 6,5); ceci est pour une utilisation sur plusieurs tests. NOTE: Les concentrations finales des inhibiteurs de NA dans la réaction volume (50 ul de dilution du virus + 50 ul d'inhibiteur NA + 50 ul de 300 uM Muñana) sont de 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM et 10 000 nM, respectivement. La concentration finale ne comprend pas les 100 pi de solution d'arrêt. Conserver tous les inhibiteurs de NA dilutions à 2-8 ° C. La date d'expiration est le même que celui des stocks de maître. Préparer les dilutions de virus dans un tampon de dosage contenant 0,1% 1x agent tensio-actif NP-40 dans un bloc 96 puits profonds. Utiliser des dilutions de virus sur la base des résultats d'analyse de l'activité NA provenant de la section 2. Utilisez un volume total de 2 ml par virus pour tester quatre inhibiteurs de NA. NOTE: Préparer deux puits (1 ml par puits) par le virus dans un bloc 96 puits profonds. Des exemples de dilutions de virus pour le virus de 1, 2 et 3 sont présentés dans le tableau 1. Répartir le volume requis d'inhibiteurs de NA (préparé selon l'étape 3.2) dans un réservoir de 8 puits profond. A partir de là, se dispenser 50 pi d'inhibiteurs de NA à des dilutions allant de 0 nM (2x essai buffer seulement) à 30 000 nM dans les rangées A à H de manière claire, à 96 puits, une plaque à fond plat. REMARQUE: La mise en page de plaque est illustrée à la figure 3. Ajouter 50 ul de virus d'essai dilué par puits dans les colonnes 1-11 et 50 pl par puits de tampon de dosage 1x seulement à la colonne 12. Tapoter doucement la plaque pour mélanger et incuber à température ambiante pendant 45 min. Couvrir la plaque avec un scellant de plaque pour éviter l'évaporation. Ajouter 50 ul de 300 uM Muñana (préparé selon l'étape 1.4) par puits et tapoter doucement la plaque pour mélanger. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 1 h. Couvrir la plaque avec un scellant de plaque pour éviter l'évaporation. Ajouter 100 ul de solution d'arrêt (préparé selon l'étape 1.6) à chaque puits et tapoter doucement la plaque pour mélanger. Lire la plaque à l' aide d' un fluorimètre. Utiliser une longueur d'onde d'excitation de 355 nm et une longueur d'onde d'émission de 460 nm, comme décrit précédemment. 4. Calcul de laLes valeurs de CI50 REMARQUE: La v1.2 JASPR est un logiciel d'ajustement de courbe qui permet le calcul des valeurs de CI50. Le logiciel a été mis au point par la Division de la grippe au CDC, Atlanta, États-Unis. Le logiciel utilise l'équation: V = V max x (1 – ([I] / (K i + [I]))), où V max est la vitesse maximale de métabolisme, [I] est la concentration en inhibiteur, V est la réaction étant inhibée, et K i est l'IC 50 pour la courbe d'inhibition. Copier et coller les données brutes délivrées par le fluorimètre dans une feuille de calcul dans un format de plaque à 12 colonne (96 puits), en commençant par la cellule A1. REMARQUE: Les données brutes à partir de chaque plaque postérieure doit être décalée d'une ligne vide. Si chaque virus a été testé contre les quatre inhibiteurs de NA, coller les données brutes dans un ensemble de quatre (avec une ligne vide entre chaque plaque). Ouvrez le logiciel de montage et clbeurk sur l'onglet « Expérience ». Choisissez "2-médicaments alternatifs Fluoro 11 échantillons." Cliquez sur l'onglet « Options » et cochez « Générer des graphiques. » Cliquez sur « Options » à nouveau, puis cliquez sur l'onglet « Nouvelle clé ». Enregistrez le fichier .csv « de inhibition_key » dans le même dossier que le fichier tableur de données brutes. Dans le fichier inhibition_key, liste de tous les noms d'échantillons ci-dessous l'identifiant. Chaque nom de l'échantillon doit être unique. Si quatre inhibiteurs de NA ont été testés, insérer des espaces pour deux lignes supplémentaires ci-dessous Oseltamivir et tapez « Peramivir » et « Laninamivir. » Enregistrez les modifications apportées au fichier inhibition_key. Retour à la fenêtre « jaspr v 1.2 Ajustement de la courbe d'inhibition » et sélectionnez le fichier de données brutes comme le « Fichier expérience » et inhibition_key comme le « fichier clé. » Exécutez l'analyse. Enregistrer les résultats dans des formats .csv et .pdf. REMARQUE: Le logiciel automatiquement une courbe tracer d'inhibition (RFU contnst NA Les concentrations d'inhibiteur), comme le montre la Figure 4. Le programme calcule également les valeurs de CI50 pour chaque virus contre un inhibiteur de NA individuel (Figure 4). En outre, JASPR présente les valeurs de CI50 et du signal à bruit de fond (S / B) rapport dans un format de tableur. Les valeurs de base peuvent différer d'un laboratoire à en fonction du fluorimètre utilisé. Au Melbourne WHOCCRRI, l'arrière-plan des valeurs pour 100 uM plage de Munana de 50 à 120 RFU. Pour une valeur IC 50 fiable, un rapport S / B de ≥10 est préféré, bien qu'un rapport inférieur à 10 est encore acceptable, en particulier pour les virus mutants qui ont une très faible activité NA. Inspecter les valeurs de CI50 et les formes des courbes générées par le logiciel. Tous les points de données devraient tomber sur ou à proximité de la courbe; si elles ne le font pas, répéter le test d'inhibition NA. NOTE: Pour les virus qui affichent des valeurs IC 50 anormalement élevées, l'essai doit être répétitioned pour confirmer le résultat.