Immunfluoreszenzanalyse der Stressgranulat-Bildung nach bakterieller Herausforderung von Säugetierzellen
Summary
Wir beschreiben eine Methode zur qualitativen und quantitativen Analyse der Stressgranulatbildung in Säugetierzellen, nachdem die Zellen mit Bakterien und einer Anzahl unterschiedlicher Belastungen herausgefordert wurden. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um die zelluläre Stressgranulat-Antwort in einem breiten Bereich von Wirts-bakteriellen Wechselwirkungen zu untersuchen.
Abstract
Die Fluoreszenz-Bildgebung von zellulären Komponenten ist ein wirksames Instrument zur Untersuchung von Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen. Pathogene können viele verschiedene Merkmale infizierter Zellen beeinflussen, darunter Organellen-Ultrastruktur, zytoskeletale Netzwerkorganisation sowie zelluläre Prozesse wie Stressgranulat (SG). Die Charakterisierung, wie Pathogene Host-Prozesse untergraben, ist ein wichtiger und integraler Bestandteil des Feldes der Pathogenese. Während variable Phänotypen leicht sichtbar sind, ist die genaue Analyse der qualitativen und quantitativen Unterschiede in den zellulären Strukturen, die durch die pathogene Herausforderung induziert werden, für die Festlegung statistisch signifikanter Unterschiede zwischen experimentellen und Kontrollproben unerlässlich. SG-Bildung ist eine evolutionär konservierte Stressreaktion, die zu antiviralen Reaktionen führt und seit langem mit viralen Infektionen untersucht wird 1 . SG-Bildung wirkt sich auch auf Signalkaskaden aus und kann noch andere noch unbekannte Konsequenzen habenUnces 2 Die Charakterisierung dieser Stressreaktion auf andere Pathogene als Viren, wie bakterielle Pathogene, ist derzeit ein aufstrebendes Forschungsgebiet 3 . Dennoch ist die quantitative und qualitative Analyse der SG-Bildung noch nicht routinemäßig, auch in den viralen Systemen. Hier beschreiben wir ein einfaches Verfahren zur Induktion und Charakterisierung der SG-Bildung in nicht infizierten Zellen und in mit einem zytosolischen Bakterienpathogen infizierten Zellen, die die Bildung von SGs als Reaktion auf verschiedene exogene Spannungen beeinflussen. Die Analyse der SG-Bildung und -Anlage wird durch die Verwendung einer Anzahl von verschiedenen SG-Markern und des Spotdetektor-Plugins von ICY, einem Open-Source-Bildanalyse-Tool, erreicht.
Introduction
Die Visualisierung von Host-Pathogen-Interaktionen auf zellulärer Ebene ist eine leistungsstarke Methode, um Einblicke in pathogene Strategien zu gewinnen und wichtige Zellwege zu identifizieren. In der Tat können Pathogene als Werkzeuge verwendet werden, um wichtige zelluläre Ziele oder Strukturen zu lokalisieren, da sich Pathogene entwickelt haben, um zentrale zelluläre Prozesse als Strategie für ihr eigenes Überleben oder ihre Ausbreitung zu untergraben. Die Visualisierung von zellulären Komponenten kann durch rekombinante Expression von fluoreszenzmarkierten Wirtsproteinen erreicht werden. Während dies eine Echtzeitanalyse ermöglicht, ist die Erzeugung von Zelllinien mit speziell markierten Wirtsproteinen sehr aufwendig und kann zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. Zweckmäßiger ist der Nachweis von zellulären Faktoren, die spezifische Antikörper verwenden, da mehrere Wirtsfaktoren gleichzeitig analysiert werden können und einer nicht auf einen bestimmten Zelltyp beschränkt ist. Ein Nachteil ist, dass nur eine statische Ansicht erfasst werden kann, da die Immunfluoreszenzanalyse die Wirtszell-Fixierung erfordertIon. Ein wichtiger Vorteil der Immunfluoreszenz-Bildgebung ist jedoch, dass sie sich sowohl qualitative als auch quantitative Analysen eignet. Dies wiederum kann verwendet werden, um statistisch signifikante Unterschiede zu erhalten, um neue Einblicke in Host-Pathogen-Wechselwirkungen zu liefern.
Fluoreszierende Bildanalyse-Programme sind leistungsstarke analytische Werkzeuge für die Durchführung von 3D- und 4D-Analysen. Allerdings sind die hohen Kosten der Software und ihre Wartung machen Methoden auf freie Open-Source-Software mehr attraktiv. Eine sorgfältige Bildanalyse mit Bioanalyse-Software ist wertvoll, da sie die visuelle Analyse untermauert und bei der Zuweisung statistischer Signifikanzen das Vertrauen in die Richtigkeit eines gegebenen Phänotyps erhöht. Bisher wurden SGs mit der freien ImageJ Software analysiert, was die manuelle Identifikation einzelner SGs 4 erfordert. Hier stellen wir ein Protokoll für die Induktion und Analyse der zellulären SG-Bildung im Rahmen von bac zur VerfügungTerial-Infektionen mit der freien Open-Source-Bio-Bild-Analyse-Software ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). Die Bio-Bildanalyse-Software verfügt über ein eingebautes Spot-Detektor-Programm, das sich hervorragend für die SG-Analyse eignet. Es ermöglicht die Feinabstimmung des automatisierten Erkennungsprozesses in bestimmten Regionen von Interesse (ROIs). Dies überwindet die Notwendigkeit einer manuellen Analyse einzelner SGs und beseitigt die Abtastvorspannung.
Viele Umgebungsbelastungen induzieren die Bildung von SGs, die phasen-dichte zytosolische, nicht-membranöse Strukturen von 0,2 – 5 μm im Durchmesser 5 , 6 sind . Diese zelluläre Antwort ist evolutionär in Hefe, Pflanzen und Säugetieren konserviert und tritt auf, wenn die globale Protein-Translation gehemmt wird. Es handelt sich um die Aggregation von blockierten Translationsinitiationskomplexen in SGs, die als Haltungsplätze für translational-inaktive mRNAs betrachtet werden, was eine selektive Translation einer Untermenge von zellulären mRNAs ermöglicht.Nach der Beseitigung der Belastung, SGs auflösen und globale Preise der Proteinsynthese wieder aufnehmen. SGs bestehen aus Translationsdehnungsinitiationsfaktoren, Proteinen, die an dem RNA-Metabolismus beteiligt sind, RNA-bindende Proteine sowie Gerüstproteine und Faktoren, die an der Wirtszell-Signalisierung 2 beteiligt sind , obwohl die genaue Zusammensetzung in Abhängigkeit von der angewandten Belastung variieren kann. Umwelteinflüsse, die die SG-Bildung induzieren, schließen die Aminosäure-Verhungern, die UV-Bestrahlung, den Hitzeschock, den osmotischen Schock, den endoplasmatischen Retikulumstress, die Hypoxie und die Virusinfektion 2 , 7 , 8 ein . Es wurde viel Fortschritte gemacht, um zu verstehen, wie Viren die SG-Bildung induzieren und auch untergraben, während wenig darüber bekannt ist, wie andere Pathogene wie Bakterien-, Pilz- oder Protozoenpathogene diese zelluläre Stressreaktion 1 , 7 beeinflussen .
ShigeLla flexneri ist ein gram-negatives fakultatives zytosolisches Pathogen des Menschen und der Erreger von schweren Durchfall oder Shigellosis. Shigellosis ist eine große öffentliche Gesundheit Belastung und führt zu 28.000 Todesfälle jährlich bei Kindern unter 5 Jahren im Alter von 9 , 10 . S. flexneri infiziert das Kolon-Epithel und verbreitet Zelle-zu-Zelle durch Entführung der Zytoskelettkomponenten des Wirts 11 , 12 . Die Infektion des Epithels unterstützt die Replikation von S. flexneri innerhalb des Cytosols, aber infizierte Makrophagen sterben durch einen entzündlichen Zelltodprozess namens Pyroptose. Infektion führt zu einer massiven Rekrutierung von Neutrophilen und einer schweren Entzündung, die von Hitze, oxidativem Stress und Gewebezerstörung begleitet wird. Während also infizierte Zellen internen Belastungen durch Infektion induziert werden, wie z. B. Golgi-Störung, genotoxischer Stress und zytoskeletale UmlagerungS, infizierte Zellen sind auch Umweltbelastungen durch den entzündlichen Prozess unterworfen.
Die Charakterisierung der Wirkung von S. flexneri- Infektion auf die Fähigkeit von Zellen, auf Umweltbelastungen mit einer Anzahl von SG-Markern zu reagieren, hat gezeigt, dass die Infektion zu qualitativen und quantitativen Unterschieden in der SG-Zusammensetzung führt 3 . Allerdings ist wenig über andere bakterielle Pathogene bekannt. Hier beschreiben wir eine Methodik für die Infektion von Wirtszellen mit dem zytosolischen Pathogen S. flexneri , die Beanspruchung von Zellen mit unterschiedlichen Umweltbelastungen, die Markierung von SG-Komponenten und die qualitative und quantitative Analyse der SG-Bildung und Zusammensetzung im Kontext von infizierten Und nicht infizierten Zellen. Diese Methode ist weithin anwendbar auf andere bakterielle Pathogene. Zusätzlich kann die Bildanalyse der SG-Bildung für Infektionen durch Viren oder andere Pathogene verwendet werden. Es kann verwendet werden, um SG zu analysierenBildung bei Infektion oder die Wirkung einer Infektion auf die SG-Bildung als Reaktion auf exogene Spannungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Induktion, Lokalisierung und Analyse von SGs in nicht-infizierten Zellen und Zellen, die mit dem cytosolischen Pathogen S. flexneri in Gegenwart oder Abwesenheit von exogenem Stress infiziert sind. Mit Hilfe der kostenlosen Imaging-Software erlauben die Protokolle die präzise qualitative und quantitative Analyse der SG-Bildung, um die Unterschiede in den gegebenen Phänotypen zu identifizieren und statistisch zu adressieren.
Es gibt me…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PS ist ein Empfänger der Bill und Melinda Gates Grand Challenge Grant OPP1141322. PV wurde von einem Schweizerischen National Science Foundation Early Postdoc Mobility Stipendium und einem Roux-Cantarini Postdoktorandenstipendium unterstützt. PJS wird von einem HHMI-Stipendium und ERC-2013-ADG 339579-Entschlüsselung unterstützt.
Materials
| Primary Antibodies | |||
| eIF3b (N20), origin goat | Santa Cruz | sc-16377 | Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300 |
| eIF3b (A20), origin goat | Santa Cruz | sc-16378 | Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300 |
| eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) | Cell Signaling | 3411 | Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800 |
| eIF4AI, origin goat | Santa Cruz | sc-14211 | Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200 |
| eIF4B, origin rabbit | Abcam | ab186856 | Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300 |
| eIF4B, origin rabbit | Cell Signaling | 3592 | Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100 |
| eIF4G, origin rabbit | Santa Cruz | sc-11373 | Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300 |
| G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Widely used SG marker. Dilution 1 in 300 |
| Tia-1, origin goat | Santa Cruz | sc-1751 | Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300 |
| Alexa-conjugated Secondary Antibodies | |||
| A488 anti-goat , origin donkey | Thermo Fisher | A-11055 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-goat, origin donkey | Thermo Fisher | A-11057 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
| A488 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A-21202 | Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A10037 | Dilution 1 in 500 |
| A647 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A31571 | Dilution 1 in 500 |
| A488 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A-21206 | Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A10042 | Dilution 1 in 500 |
| Other Reagents | |||
| Shigella flexneri | Available from various laboratories by request | ||
| Tryptone Casein Soya (TCS) broth | BD Biosciences | 211825 | Standard growth medium for Shigella, application – bacterial growth |
| TCS agar | BD Biosciences | 236950 | Standard growth agar for Shigella, application – bacterial growth |
| Congo red | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application – bacterial growth |
| Poly L lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | Useful to coating bacteria to increase infection, application – infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application – infection |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application – cell culture |
| DMEM | Life Technologies | 31885 | Standard culture medium for HeLa cells, application – cell culture |
| Fetal calf serum | Biowest | S1810-100 | 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | 1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Reagent diluent, application – cell culture |
| Sodium arsenite | Sigma-Aldrich | S7400 | Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application – stress inducer |
| Clotrimazole | Sigma-Aldrich | C6019 | Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application – stress inducer |
| PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | 4% PFA is used for standard fixation of cells, application – fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application – permeabilization |
| A647-phalloidin | Thermo Fisher | A22287 | Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application – staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application – staining |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | BR701501 | Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application – staining |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application – mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
| 24-well cell culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Standard tissue culture plates, application – cell culture |
| 12-mm glass coverslips | NeuVitro | 1001/12 | Cell culture support for immunofluorescent applications, application – cell support |
| forceps | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
| Programs and Equipment | |||
| Prism | GraphPad Software | Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application – data analysis | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | Confocal microsope, application – image acquisition | |
| Imaris | Bitplane | Professional image analysis program, application – data analysis | |
| Excel | Microsoft | Data analysis and graphing program, application – data analysis | |
Riferimenti
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