Yağ vücut Organ kültür sistemi içinde Aedes Aegypti, bir vektör Zika virüs

1. çözümler ve Kimyasalları hazırlama ağırlığında tarafından hisse senedi çözüm Amino asit hazırla 4 X bir amino asit hisse senedi çözüm 23 , 24 ve Tablo 1 ‘ de verilen konsantrasyonları göre bir Erlenmeyer şişesi 20 farklı amino asit ekleme. Not: bazı durumlarda, amino acid(s) olabilir eriyik–dan hariç ve mannitol osmolytes eşit bir konsantrasyon korumak için eşit molar miktarda tarafından yerine. İstenen birimin çözüm üretmeye GKD 2 O uygun miktarda ekleyin. Amino asitler tamamen çözülmüş ki, emin olmak için yavaşça sıvı tamamen temizlenene kadar sürekli karıştırarak ısı; hafif bir sarı renk tonu üzerinde alacak. Not: pH 6-HCl bazı çözülmeye daha hidrofobik amino asitler sağlar ekleyerek azaltmak gerekli olabilir. Aliquot çözüm ve 0.2 µm ile bir şırınga filtre kullanarak filtre-steril gözenek boyutu. -20 ° c ilâ 6 ay boyunca kapalı bir kapta mağaza. APS Not: bkz: 25. 20 X için hisse senedi çözüm tuz, 50 mL su Tablo 2 ‘ de listelenen tuzları birleştirmek. Tamamen eriyene kadar karıştırın. Not: Bu çözüm tuz tamamen erimesi için biraz ısıtmak gerekli olabilir. Steril-0.2 µm ile bir şırınga filtre kullanarak filtre boyutu gözenek ve çözüm -20, 50 mL tüp depolamak ° C. Kalsiyum hisse senedi çözüm 50 X kalsiyum hisse senedi çözüm için Kalsiyum klorür 0,90 g 100 mL su (Tablo 3) Ekle; tamamen eriyene kadar karıştırın. Steril-filtre kullanarak bir 0.2 µm gözenek boyutu ile aliquot çözüm 50 mL tüpler içine filtre ve depolamak -20 ° c Tris arabellek (pH 7,4) Tris tampon, tuz ve Tablo 4 ‘ te listelenmiş çözümleri birleştirmek ve GKD 2 O eklemek için ilâ 100 mL. Steril-filtre kullanarak bir 0.2 µm gözenek boyutu ve aliquot ile çözüm 50 mL tüpler içine filtre; mağaza oda sıcaklığında. Yağ vücut kültür orta yağ vücut kültür ortamı hazırlamak için yukarıda listelenen tüm çözümleri hazırlayın. 200 mL yağ vücut kültür orta yapmak için Tablo 5 birimlerinde göre onları birleştirmek. PH 7.2 NaOH veya HCl kullanarak için ayarlamak. Steril-filtre 0.2 µm gözenek boyutu ile bir şırınga filtre kullanarak çözüm. Çözüm 15 mL aliquots bölmek ve 6 aya kadar saklamak-20 ° C’de. 2. Diseksiyon için hazırlık stereomicroscope (10-20 x büyütme) aydınlatma ile hazırlamak ve iki Ultra-ince cımbız ve mikro diseksiyon makası yatıyordu. Tüm çözümler deneme için gerekli hazır olun. Oda sıcaklığında yağ vücut kültür ortamına çözülme. Not: Precipitants yavaşça 30’dan daha yüksek çözüm Isıtma tarafından çözülmüş ° C. Bir aspiratör ile yetişkin dişi sivrisinekler (3-7 gün sonra ortaya çıkması) toplamak ve onları anestezi karbon dioksit ya da buz kullanma Not: Bir kez anestezi, sivrisinekler CO 2 altında için en kısa sürede mümkün, 20 dk. alternatif olarak geçmeyen tutulmalıdır, buza anestezi ve yaklaşık 30 dk tutulur sivrisinekler 6-şey plaka ile APS 3 mL başına iyi hazırlanın. 3. Yağ vücut diseksiyon parçalara stereomicroscope odaklanmak ve rahat bir yükseklik için sandalye ayarlamak. Bir içbükey mikroskop slayt mikroskop yüzey üzerine yerleştirin ve APS iki damla merkezine ekleyin. Bir forseps kullanarak bir bacak tarafından bir sivrisinek kadar almak ve mikroskop slayt üzerinde APS yüzeye transfer. Dikkatle sivrisinek tarafından Toraks, sol elinde Forseps ile kavrama ve ventral tarafı yukarı doğru sivrisinek döndürür. Vücut tarafından Toraks sabit tutarken, sağ el Forseps ile son iki karın kesimleri tutun ve yavaşça çekin. Not: Son iki karın kesimleri karın ve ekli yumurtalıklar, Malpighi tübüllerin, hindgut ve midgut ayrı; Bazen kırpma karın dışarı slayt. Onlar kaldırılmamış, forseps kapalı ipuçları oluşturulan küçük deliğe yerleştirin ve kalan dokular kaldırırsınız. Doğru forseps bir kenara koyun ve bahar makas al. Bir bıçak karın Toraks aşağıda segmenti kadar delik kaydırın. Yavaşça ve hızla karın uzunlamasına kesilmiş. Not: kesim yapıldıktan sonra bu hemen oluşmayabilir rağmen karın dışa, genişletmek başlamalıdır. Devam yanal kesiği biraz aşağıda burada ilk kesme sona erdi ve toraks aşağıda olacak ikinci kesim yapmak. Not: Karın sonra Aç ve kütikül yukarı ve yağ cesetleri yan-APS içinde dalmış Toraks dan ayırmak. Karın bu beden duvarı vitro kültür yağ vücut hazırlıktır. Forseps bir çift ucu kullanarak APS çözüm yağ vücutlarından kaldırın ve oda sıcaklığında APS içeren 6-şey plaka eriyik–dan aktarmak. Doku yağ vücut kültür ilerleyen önce yaklaşık 0,5 h için dinlenmeye izin. 4. Yağ vücut kültür onları equilibrate en az 0,5 h için oda sıcaklığında yağ organları APS üzerinde kuluçkaya. Yağ cesetleri forseps ucu kullanarak transfer ve nazikçe onları dışarı APS çözüm kaldırın. Ucunu yağ vücut kültür orta düşük. Not: Yağ vücut orta yüzeyinde açın ve serbestçe yüzen gerekir. Yağ vücut kültür genellikle 96-şey Kaplamalar, 150-200 µL her iyi orta ile gerçekleştirilir. Bir de en çok üç bireysel yağ organları sığabilecek, ve onlar daha 12 h (yayınlanmamış kişisel sonuçlar) uygun. Kuluçka dönemi sonra yağ cesetleri ortamından aşağı akım işleme uygun Kimyasalları içeren 1.5 mL santrifüj tüpleri içine transfer. Not: Tipik analizleri qPCR 16 , 17 , 18 , 19, Western Blot 18 , içerir. 20, transcriptomics 26, proteomik 21 veya metabolomics 22.