Fetten Körper Kultur Organsystem in Aedes Aegypti, Überträger von Zika-Virus

1. Vorbereitung der Lösungen und Reagenzien Aminosäure-Stammlösung Prepare a 4 X Aminosäure-Stammlösung 23 , 24 durch Wiegen und ein Erlenmeyerkolben gemäß den in Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen 20 verschiedene Aminosäuren hinzugefügt. Hinweis: In einigen Fällen Amino acid(s) kann die Lösung ausgeschlossen und durch ersetzt werden gleiche molare Mengen von Mannit, einen gleichen Konzentration von Osmolyten beizubehalten. Fügen Sie die entsprechende Menge an DdH 2 O, das gewünschte Volumen der Lösung zu produzieren. Um sicherzustellen, dass die Aminosäuren vollständig aufgelöst haben, erhitzen schonend und ständig rühren, bis die Flüssigkeit vollständig klar ist, es wird auf einen leichten gelben Farbton nehmen. Hinweis: Es möglicherweise erforderlich, den pH-Wert auf 6 zu reduzieren, durch Zugabe von HCl um einige der mehr hydrophobe Aminosäuren auflösen können. Aliquot der Lösung und Sterilfilter mit einer Spritze-Filter mit einer 0,2 µm Porengröße. Store in einem verschlossenen Behälter bei-20 ° C bis zu 6 Monate. APS Hinweis: 25 zu sehen. Für die 20 X Salz-Stammlösung, kombinieren die Salze in 50 mL Wasser in Tabelle 2 aufgeführt. Rühren, bis aufgelöst. Hinweis: Es möglicherweise erforderlich, die Lösung, um vollständig die Salze lösen sich leicht erwärmen. Steril-Filter mit einer Spritze-Filter mit einer 0,2 µm Porengröße und speichern Sie die Lösung in einen 50-mL-Tube bei-20 ° c Kalzium-Stammlösung für die 50 X Kalzium-Stammlösung, 100 mL Wasser (Tabelle 3) 0,90 g Calciumchlorid hinzufügen; rühren vollständig aufgelöst. Steril-Filter mit einer Spritze mit einer 0,2 µm Porengröße, aliquoten die Lösung in 50 mL Röhrchen zu filtern und Lagerung bei-20 ° c Tris-Puffer (pH 7,4) der Tris Puffer, das Salz und die in Tabelle 4 aufgeführten Lösungen zu kombinieren und fügen DdH 2 O bis 100 mL. Mit einer Spritze steril-Filter Filtern mit 0,2 µm Porengröße und aliquoten die Lösung in 50 mL Röhrchen; bei Raumtemperatur lagern. Fetten Körper Kulturmedium um das Kulturmedium fetten Körper vorzubereiten, bereiten Sie alle oben aufgeführten Lösungen. Kombinieren sie nach Volumen in Tabelle 5 bis 200 mL Kulturmedium fetten Körper machen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7.2 mit NaOH oder HCl. Steril-Filter die Lösung unter Verwendung eines Spritze-Filters mit einer Porengröße von 0,2 µm. Die Lösung in 15-mL-aliquoten teilen und bei-20 ° C bis zu 6 Monate zu speichern. 2. Vorbereiten der Dissektion bereiten ein Stereomikroskop (10-20 X Vergrößerung) mit Beleuchtung und legen Sie zwei ultra-feine Pinzette und Schere Mikro Dissektion. Bereiten Sie alle Lösungen für das Experiment notwendig. Die fetten Körper Nährmedium auf Zimmertemperatur auftauen. Hinweis: Fällungsmitteln können aufgelöst werden, durch sanft Erhitzen der Lösung nicht höher als 30 ° c Mit einer Absauganlage, Erwachsene weibliche Stechmücken (3-7 Tage nach dem Aufgang) zu sammeln und sie zu betäuben mit Kohlendioxid oder Ice Hinweis: Einmal betäubt, die Mücken sollten ständig CO 2 für die kürzeste Zeit möglich, nicht länger als 20 min. Alternativ, die Mücken können auf dem Eis betäubt und hielt für ca. 30 min. Bereiten Sie eine 6-Well-Platte mit 3 mL APS pro Bohrloch. 3. Fetten Körper Dissektion sezierenden Stereomikroskop zu konzentrieren und stellen Sie den Stuhl auf eine komfortable Höhe. Stellen einen konkaven Objektträger auf die Mikroskop-Oberfläche und zwei Tropfen des APS ins Zentrum. Heben Sie eine Mücke, indem ein Bein mit einer Pinzette und überträgt es auf das APS-Oberfläche auf dem Objektträger. Sorgfältig die Mücke durch den Brustkorb mit der Zange in der linken Hand greifen und die Mücke zu drehen, so dass der Bauchseite nach oben ist. Halten den Körper stetig durch den Brustkorb, die letzten zwei Abdominalsegmente mit der Zange in der rechten Hand greifen und ziehen. Hinweis: Die letzten zwei Abdominalsegmente werden von den Bauch und den angeschlossenen Eierstöcke Malpighian Tubuli, Enddarm und Mitteldarm zu trennen; Manchmal wird die Ernte aus dem Bauch gleiten. Wenn sie nicht entfernt wurden, legen Sie die geschlossenen Spitzen der Zange in das kleine Loch erstellt und das übrige Gewebe zu entfernen. Die richtige Zange beiseite und holen den Frühling-Schere. Schieben Sie eine Klinge in das Loch in den Bauch bis zu Segment unter den Brustkorb. Sanft und schnell schneiden Sie den Bauch längs. Hinweis: Sobald der Schnitt gemacht hat, der Bauch sollten anfangen, nach außen erweitern obwohl dies nicht sofort auftreten kann. Fahren Sie mit den zweiten Schnitt machen einen seitlichen Schnitt unter der Brust und leicht unter dem erste Schnitt beendet werden. Hinweis: Der Bauch sollte dann eröffnen und distanziert sich ausdrücklich von den Brustkorb mit der Kutikula, und das Fett stellen Seite inmitten der APS. Dieser Körper Bauchdecke ist die fetten Körper Vorbereitung für in-vitro- Kultur. Heben die Fett-Körper aus der APS-Lösung, mit der Spitze eines Paares von Zangen und übertragen Sie sie von der Lösung auf die 6-Well-Platte mit APS bei Raumtemperatur. Das Gewebe ca. 0,5 h ruhen bevor voran, um die fetten Körperkultur ermöglichen. 4. Fett-Body Culture brüten die Fett Körper auf APS bei Raumtemperatur mindestens 0,5 h zu ihnen equilibrate. Übertragen die Fett stellen mit der Spitze der Zange und heben Sie sie vorsichtig aus der APS-Lösung. Senken Sie die Spitze in das Fett des Körpers Kulturmedium. Hinweis: Sollte der Körper Fett auf der Oberfläche des Mediums öffnen und frei schweben. Die fetten Körperkultur erfolgt in der Regel in 96-Well-Platten, mit 150-200 µL Medium in jede Vertiefung. Man kann gut passen bis zu drei einzelnen Fett Körper, und sie sind für mehr als 12 h (unveröffentlichte persönliche Ergebnisse). Nach der Inkubationszeit der Körper Fett aus dem Medium in 1,5 mL Zentrifuge Röhrchen mit den entsprechenden Reagenzien für downstream-Processing übertragen. Hinweis: Typische Analysen umfassen qPCR 16 , 17 , 18 , 19, Western Blot- 18 , 20, Transkriptom 26, Proteomics 21 oder Metabolomik 22.