דגם IL-8 עכבר transgenized חולף עבור<em> בויבו</emמעקב ארוך טווח אחר תגובות דלקתיות
Summary
השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה של IL- 8 האמרגן תלוי דלקת ההפעלה הריאות של עכברים באמצעות הדמיה פליטת אור לא פולשני (BLI). אותו בעל חיים יכול להיות נתון BLI מספר פעמים במשך עד חודשיים מזמן המסירה של הכתב לוציפראז לבנות.
Abstract
דלקת בדרכי הנשימה קשורה לעיתים קרובות לזיהומים חיידקיים ומייצגת גורם עיקרי למחלת ריאות. קביעת in vivo של היכולות הפרו דלקתיות של גורמים שונים הוא מאתגר ומחייב נהלים מסוף, כגון שטיפת ברונכואלוואלית והסרת הריאות לניתוח באתר , מונע הדמיה האורך באותו עכבר. הנה, דלקת ריאות הוא המושרה באמצעות החדרת intratracheal של Pseudomonas aeruginosa תרבות supernatant (SN) בעכברים transgenized חולף להביע את הגן הכתב בלוציפראז תחת שליטה של האמרגן heterologous IL-8 בקר. ביטוי לוציפראז בריאה הוא פיקוח על ידי in vivo bioluminescent תמונה (BLI) ניתוח מעל מסגרת זמן של 2.5-48 שעות לאחר הטעם. ההליך יכול לחזור על עצמו מספר פעמים בתוך 2 – 3 חודשים, ובכך לאפשר את הערכת התגובה הדלקתית בעכברים אותו עםהצורך לסיים את בעלי החיים. גישה זו מאפשרת מעקב אחר גורמים פרו-אנטי-דלקתיים הפועלים בזמן הריאה בזמן אמת ונראית מתאימה למחקרים פונקציונליים ופרמקולוגיים.
Introduction
מחלות ריאות כרוניות, כגון אסתמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), סיסטיק פיברוזיס (CF) וברונכיקטסיס, מאופיינים בדלקת דרכי הנשימה. דלקת בדרכי הנשימה מאופיינת בצקת, חדירת תאים, לימפוציטים מסוג T ותאי תא של תורן, הפרשות בדרכי הנשימה, ותצהיר קולגן מוגזם. CF הוא הפרעה רב-מערכתית, והסיבה העיקרית לתמותה ולתחלואה היא זיהום חיידקית ריאה עם הגברת החרפת הריאות. הירידה בתפקוד הריאות מנבאת תוצאה נמוכה יותר באופן משמעותי 1 , 2 , 3 , 4 .
מצב הדלקת של דרכי הנשימה נמדד בדרך כלל באמצעות הערכה של סמנים אימונולוגיים שגויסו במהלך התהליך הדלקתי בחומר הנגזר מדרכי הנשימה התחתונות והתחתונות, כגון כיח, המספק res משתנה. Bronchoscopies מבוצעות גם 5 . מודלים Murine הם כלים חשובים לחקר הפתוגנזה ואבולוציה של מחלות המאופיינות דלקת דרכי הנשימה ואשר טיפולים יעילים או תרופות עדיין לא זוהו. מודלים של בעלי חיים של דלקת ריאות ודלקת שימשו כדי לחקור אסטמה אינטראקציות מארח פתוגן, כולל התפקיד של כימיקלים המדמים את התנאים האנושיים ( למשל, חשיפה עשן סיגריה, LPS, elastase, ovalbumin, פולי אני: C, וכו ' , כמו כמו גם שילובים של לעיל) 6 . המדידה של הפרמטרים הקשורים לדלקת דורשת את ההקרבה של החיות, כאשר נדרשות גישות פולשניות למדידת גורמים כגון עומס חיידקי, ציטוקינים בריאות, ואספקה של נוזל שטיפה bronchoalveolar (BAL). כמו כן, בדיקות היסטולוגית נדרשים לעתים קרובות. האפשרות של קבלת מידע על קינטיקה התגובה דלקתית דורש שימוש של numעכברים. לכן, טכניקה שתאפשר קבלת מידע כזה ללא צורך להקריב את בעלי החיים היא בעלת ערך על בסיס טכני, אתי, כלכלי ותפעולי.
IL-8 הוא שחקן חיוני בתהליך הדלקת, לגייס לויקוציטים לרקמה דלקתית. הוא מייצג קריאה מולקולארית לחקר הפעלת מסלול דלקתית. MIP-2 ו KC עשוי להיות homologs תפקודית של IL-8 האנושי בעכברים. עכברים מבטאים רק קולטן פוטנציאלי אחד של IL-8, הומולוג של CXCR2 7 , 8 , אך הם מסוגלים לשנות את מקדם הגן heterologous IL-8 המניע גן של הכתב. דלקת ריאות מודל Murine לאחרונה פותחה לאחר התצפית כי מקדם IL-8 האמרגן / בלוציפראז לכתב יכול להיות transactivated בעכברים. תכונה זו מאפשרת ניצול של הדמיה פליטת אור (BLI) כדי לפקח על התגובה דלקתיים לחיות9 .
מודל זה הותאם כדי לחקור דלקת מופעלות על ידי exoproducts חיידקי ( למשל, LPS או מוצרים שפורסמו על ידי זנים חיידקים) או TNFalpha 10 , 11 . תהליך גילוי התרופה מתמקד בפיתוח ואופטימיזציה של מולקולות אנטי-דלקתיות ישנות וחדשות, אשר יכולות לטפל במחלות ריאה, כגון CF, אסטמה ו- COPD. יש לבחון במהירות ובנוחות את המרכיבים החומריים החדשים הללו במודלים של בעלי חיים, שיכולים להיות קשורים לפנוטיפים קליניים ספציפיים על מנת להקל על תכנון ניסויים קליניים חכמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבודה קודמת 11 , הוצג ניגוד בין BLI תלוי ב- bil-8-Luc ו- BAL. היא הסתמכה על מידת ההפרש של רגישות בתוך זנים העכבר 12 . מסיבה זו, היישום הראשון של המודל BIL-8-Luc לזן עכבר שונה מחייב מחקר ראשוני של התגובה הדלקתית, הן במונחים של BLI והן סמנים דלקתיים סטנדרטיים יות…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן פיברוזיס האיטלקית Cystic Foundation FFC # 18/2013, FFC # 29/2015 ועל ידי הליגה האיטלקית פיברוזיס פיברוזיס באמצעות סניף ונטו- Associozione Veneta Lotta קונטרו לה Fibrosi Cistica Onlus.
Materials
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo Imaging System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| Female inbred BalbC | Harlan Laboratories Italy | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| bIL-8-Luc plasmid | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Store the plasmid at -20 °C | |
| pGL3basic vector | Promega | E1751 | Store the vector at -20 °C |
| JetPEI DNA transfection reagent | Polyplus transfection | 201B-001G | The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7 |
| D-luciferin potassium salt 1g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Protect from light, store at -20 °C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Store the unopened kit at 4 °C |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| Gas anesthesia system XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5ml | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by a scissors |
| Hamilton 0,10 ml (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1ml | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18ga x 50mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
Riferimenti
- Barnes, P. J. Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes. J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).
- Cohen-Cymberknoh, M., Kerem, E., Ferkol, T., Elizur, A. Airway inflammation in cystic fibrosis: molecular mechanisms and clinical implications. Thorax. 68 (12), 1157-1162 (2013).
- Dhooghe, B., Noel, S., Huaux, F., Leal, T. Lung inflammation in cystic fibrosis: pathogenesis and novel therapies. Clin Biochem. 47 (7-8), 539-546 (2014).
- Durham, A. L., Caramori, G., Chung, K. F., Adcock, I. M. Targeted anti-inflammatory therapeutics in asthma and chronic obstructive lung disease. Transl Res. 167 (1), 192-203 (2015).
- Sagel, S. D. Noninvasive biomarkers of airway inflammation in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 9 (6), 516-521 (2003).
- Starkey, M. R., et al. Murine models of infectious exacerbations of airway inflammation. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 337-344 (2013).
- Cacalano, G., et al. Neutrophil and B cell expansion in mice that lack the murine IL-8 receptor homolog. Science. 265 (5172), 682-684 (1994).
- Simonet, W. S., et al. Long-term impaired neutrophil migration in mice overexpressing human interleukin-8. J Clin Invest. 94 (3), 1310-1319 (1994).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PLoS One. 7 (6), e39716 (2012).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS One. 9 (9), e106873 (2014).
