Channelrhodopsins에서 이온 선택성의 전기 생리 학적 결정을위한 전체 셀 패치 - 클램프 기록
Summary
This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.
Abstract
지난 10 년 동안 channelrhodopsins은 신경 세포 학적 연구에서 없어서는 안되게되었고, 대상 세포에서 전기 과정을 비 침습적으로 조작하는 도구로 사용되었습니다. 이러한 맥락에서, 채널로도 딘의 이온 선택성은 특히 중요하다. 이 기사는 최근 HEK293 세포의 전기 생체 학적 패치 클램프 기록을 통해 Proteomonas sulcata 의 최근 확인 된 음이온 전도성 채널로도 딘에 대한 염화물 선택성에 대한 조사를 기술 합니다. 빛에 의해 제어되는 광전류를 측정하기위한 실험 절차는 기존의 패치 – 클램프 설정의 현미경에 결합 된 신속하게 전환 가능한 이상적인 단색 광원을 필요로합니다. 실험 이전의 준비 절차는 완충 용액의 준비, 액체 접합 전위에 대한 고려, 세포의 파종 및 형질 감염 및 패치 피펫의 당김과 관련하여 개략적으로 설명됩니다. 전류 – 전압 관계의 실제 기록transfection 후 24 시간에서 48 시간 사이에 다양한 염화물 농도에 대한 reversal potential을 결정합니다. 마지막으로, 전기 생리 학적 데이터는 염화물 전도의 이론적 고려 사항과 관련하여 분석된다.
Introduction
Channelrhodopsins (ChR)는 운동성 녹조류의 눈 지점에서 발생하는 광 게이 티드 이온 채널이며 광 택 및 공포 반응에 대한 기본 광 센서 역할을합니다 1 . ChR은 2002 년에 처음으로 기술 된 이래로 optogenetics의 새로운 분야에 대한 길을 열었고 골격근, 심장 또는 뇌의 다양한 흥분성 세포, 예를 들어 3 , 4 , 5 에 적용될 수 있습니다. 표적 세포에서 ChR을 발현 시키면 각 세포의 가벼운 조절 가능한 이온 투과성을 갖게된다. 연결 컨텍스트에서 이것은 활동 전위 (AP) 발화의 활성화 6 , 7 , 8 또는 억제 9,10 (수행 된 이온에 따라 다름)을 공간적 및 시간적ChR 변이체의 이온 선택성이 어떻게 그것의 광 생성 적용을 결정 하는지를 강조하는 빛의 정밀도.
Chlamydomonas reinhardtii 와 Volvox carteri에서 처음으로 발견 된 ChR은 양성자뿐만 아니라 나트륨, 칼륨과 같은 1가 양이온, 칼슘과 마그네슘과 같은 2가 양이온에 덜 영향을 미친다 11,12,13. 오늘날, 70 가지 이상의 천연 양이온 전도성 채널 로돕신 (CCRs) 14 , 15 , 16 , 17 및 광전류 크기, 분광 감도, 동역학 및 양이온 선택도를 이용할 수 있습니다. 신경 과학에서 CCR은 a다시 세포를 활성화하고 AP를 트리거하는 데 사용되는 경우, 빛에 의해 구동되는 미생물 펌프는 수년간 뉴런을 조용하게하는 유일한 길항제였다. 2014 년에 두 그룹은 동시에 CCR이 분자 공학을 통해 추정 이온 전도 기공을 따라 극성을 바꾸어 음이온 전도성 채널로도 틴 (ACR)으로 전환 될 수 있음을 보여주었습니다 9 , 21 . 그 결과, 여러 가지 cryptophyte alga 22 , 23 , 24 에서 자연 ACR이 확인되었다. 가장 중요한 것은, ACR의 가벼운 활성화는 흡수 된 광자 당 단 하나의 전하만을 운반하는 미생물 펌프보다 훨씬 낮은 광 강도에서 신경 세포 활동의 억제를 허용하는 성인 뉴런에서 염화물 전류를 매개한다는 것이다.
ChR 활동은 HEK293 세포의 빛 유도 전류의 전기 생체 학적 패치 클램프 기록으로 직접 해결할 수 있습니다. 패치 클램프기술은 원래 1970 년대 후반에 개발되었고, Hamill et al. 높은 전류 분해능과 멤브레인 전압의 직접 제어로 작은 셀 (전체 셀 모드)에서 전류 엔티티를 기록 할 수 있습니다. 세포 배양에 적용된이 기술은 이온 및 전기 기록 조건을 정확하게 제어하고 총 전류에 대한 이온의 상대적 기여와 함께 이온 선택성을 연구 할 수있게합니다. 여기서 우리는 염소 이온 전도도를 증명하기 위해 다양한 세포 외 염화물 농도 하에서 전류 – 전압 관계를 기록함으로써 Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 의 음이온 전도성 채널로도 펩신에 대한 이온 선택성의 시험을 예시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
정의 된 이온 및 전기 조건에서 역전 전위의 결정은 ChR의 가벼운 활성화 후에 운반 된 이온 종에 대한 정보를 제공합니다. 독점적으로 하나의 이온 종이 복잡한 생리 학적 매질에서 변화되고 얻어진 역전 전위가 이론상의 Nernst 전위에 따라 이동하면,이 이온 종이 유일한 수송 된 것입니다.
그러나 ChR의 경우 전도 이온 간의 경쟁은 물론 다른 이온 종에 대한 침투성 때문에 Nern…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우수한 기술 지원을 위해 Maila Reh, Tharsana Tharmalingam, 특히 Altina Klein에게 감사드립니다. 이 연구는 독일 연구 재단 (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 to PH)과 Catalysis, UniCat, BIG-NSE (JV) 및 E4 (PH)의 우수 통합 클러스터 개념에 의해 지원되었습니다.
Materials
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E.coli/ | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E.coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
Riferimenti
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