En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos

La capacidad de visualizar los procesos de desarrollo importantes en un vertebrado in vivo ha contribuido a que el pez cebra un modelo clave para el estudio de las condiciones normales y de enfermedad (revisado en ^{1, 2).} En particular, la retina neural es una parte accesible del sistema nervioso central. La retina se presta a realizar fácilmente estudios de la neurogénesis debido a su muy organizado, sin embargo, la estructura relativamente simple, y sus tipos de neuronas altamente conservadas a través de especies de vertebrados ^3. Dinámica de comportamientos celulares tales como la proliferación, la salida del ciclo celular, la división celular asimétrica, la especificación del destino, la diferenciación y la formación de los circuitos neuronales se pueden seguir a lo largo de todo el proceso de retinogenesis, que se completa en la retina central del pez cebra por 3 d después de la fecundación ( dpf) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

Por otra parte, los requisitos funcionales de genes diferentes en cada una de las etapas mencionadas anteriormente se pueden evaluar de forma concomitante en la retina del pez cebra, proporcionando una ventaja sobre otros modelos de vertebrados en el que los fenotipos resultantes de la aplicación de técnicas gen knockout sólo puede ser evaluado en el examen post-mortem de fijo tejidos. En particular, el uso de líneas transgénicas en las que podemos visualizar y controlar la expresión de proteínas fluorescentes como transgenes reportero en la retina, nos permite obtener la resolución temporal de la expresión génica que subyace en la génesis de un tipo celular neuronal particular. Debido al rápido desarrollo de pez cebra, estos eventos pueden ser visualizados durante todo el periodo de desarrollo, proporcionando así una visión más profunda en la importancia temporal de la expresión génica en relación con la adquisición de identidad de la célula neuronal y el comportamiento celular.

Por último, estos enfoques pueden ser combinados de manera eficiente en el pez cebra con la generación de la quimera a través de trasplantes, lo que resulta en puntos de vista en dos aspectos clave de la función de genes. En primer lugar, las células trasplantadas de un embrión donante, en el que un gen particular fue derribado antes de que se desarrollan en un entorno de tipo salvaje no marcada en el examen, nos permite obtener información relevante acerca de la función de genes en una celda de manera autónoma. Esto conduce a importantes conocimientos sobre la función de los factores de destino determinantes de la retina dentro de las células progenitoras que normalmente se expresan en. Esto se ejemplifica por el examen de los resultados destino de desarrollo de progenitores que ya no pueden generar proteína funcional a partir de estos genes ^{4, 6, 8, 9.} Utilizando este enfoque, hemos demostrado que los factores determinantes muchos de destino (por ejemplo, Vsx1, atoh7, Ptf1a, Barhl2) actúan célula-autonomously para conducir destinos neuronales retinianas específicas; la falta de expresión de genes conduce principalmente a un conmutador de destino, de modo que las células con el gen desmontables permanecen viables mediante la adopción de un destino alternativo celular ^{4, 6, 7, 10.} En segundo lugar, tales experimentos quiméricos se pueden utilizar para evaluar la forma de tipo salvaje progenitores comportan cuando se desarrollan dentro de diferentes entornos genéticos. Por ejemplo, comparando el desarrollo de las células WT que normalmente expresan un gen de interés (y transgén reportero) en un WT frente a entorno de acogida manipulada (por ejemplo, eliminación de genes / caída), los efectos resultantes sobre la expresión génica y destino de las células se pueden evaluar . La falta de ciertos tipos de neuronas en el entorno de acogida, por ejemplo, se ha demostrado que influyen en el comportamiento progenitor de tipo salvaje de una manera no autónoma de células, al sesgo de ellos hacia la diferenciación en el o subrepresentadosr falta tipos de neuronas ^{4, 7, 11, 12.} Dado que las neuronas de la retina nacen en un orden histogenic conservada por la expresión secuencial temporizada de genes específicos destino determinantes neuronales (la expresión génica destino) (revisado en ^13), hemos utilizado estos métodos para demostrar cómo el momento de la expresión génica destino en progenitores de tipo salvaje se ve afectada cuando estos progenitores se desarrollan en entornos host de la retina con composiciones celulares aberrantes inducidos. A continuación, describimos estos enfoques como evidencia de cómo la combinación de técnicas relativamente estándar y ampliamente utilizado permite que el examen de las fechas de la expresión génica destino en el desarrollo de la retina progenitores ^{8, 9.}

Este protocolo describe un método experimental que combina imágenes de lapso de tiempo con la facilidad de performando el trasplante en el ex vivo el desarrollo de embrión de pez cebra a seguir mosaically individuo células marcadas a lo largo de todo el período de retinogenesis desarrollo. Mediante la realización de las manipulaciones de genes funcionales ya sea en el embrión de acogida, embrión donante, ambos o ninguno, uno puede evaluar la autonomía de células de la función génica. Este enfoque se puede adaptar ampliamente a las preguntas de investigación similares en cualquier otro sistema para el cual los componentes individuales descritos aquí son adecuados.