In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

Die Fähigkeit , wichtige Entwicklungsprozesse in einem di – vivo wirbel sichtbar zu machen , um die Herstellung der Zebrabärbling einen Schlüssel Modell für die Untersuchung normalen und Krankheitszuständen ( beschrieben in ^{1, 2)} beigetragen hat. Insbesondere ist die neurale Netzhaut eine zugängliche Teil des zentralen Nervensystems. Die Netzhaut eignet sich für leicht Studien der Neurogenese führen aufgrund ihrer hoch organisierten, aber relativ einfache Struktur, und seine hochkonservierten Neuron – Typen über Vertebratenarten ^3. Dynamik der zellulären Verhaltensweisen wie Proliferation, Zellzyklus Ausgang, asymmetrische Zellteilung, Schicksal Spezifikation, Differenzierung und neuronalen Schaltkreise Bildung kann über den gesamten Prozess von Retinogenese folgen, die in der zentralen Netzhaut des Zebrabärbling von 3 d postfertilization abgeschlossen ist ( dpf) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

Darüber hinaus können die funktionalen Anforderungen verschiedener Gene in jeder der oben genannten Stufen gleichzeitig in der Zebrabärbling Retina beurteilt werden, einen Vorteil gegenüber anderen Wirbel Modelle, in denen die Bereitstellung Phänotypen aus der Anwendung der Gen-Knockout-Techniken, kann sie nur auf Obduktion bewertet werden von Geweben fixiert. Insbesondere die Verwendung von transgenen Linien in dem wir die Expression von fluoreszierenden Proteinen als Reporter Transgenen in der Netzhaut zu visualisieren und zu überwachen, ermöglicht es uns, die zeitliche Auflösung der Genexpression zu erhalten, die die Entstehung eines bestimmten neuronalen Zelltyp zu Grunde liegt. Aufgrund der schnellen Entwicklung von Zebrabärbling können diese Ereignisse während der gesamten Entwicklungszeit visualisiert werden, wodurch tiefere Einblicke in die zeitliche Bedeutung der Genexpression Verhalten in Bezug auf neuronale Zellidentitätserfassung und Zellenbereitstellt.

Schließlich können diese Ansätze wirksam mit der Erzeugung von Chimären über Transplantationen in der Zebrabärbling kombiniert werden, was zu Einsichten in zwei wesentliche Aspekte der Genfunktion. Erstens Zellen transplantiert von einem Spender Embryo untersuchen, in denen ein bestimmtes Gen wurde umgeworfen, während sie in einem unbeschrifteten Wildtyp-Umgebung zu entwickeln, ermöglicht es uns, relevante Informationen über die Genfunktion in einem zellautonome Weise zu erhalten. Dies führt zu wichtigen Erkenntnissen über die Funktion der retinalen Schicksal bestimmenden Faktoren in den Vorläuferzellen sie in der Regel ausgedrückt in. Dies wird durch die Prüfung des Entwicklungsschicksal Ergebnis von Vorläufern exemplifiziert , die nicht mehr funktionsfähiges Protein aus diesen Genen erzeugen können ^{4, 6, 8, 9.} Unter Verwendung dieses Ansatzes haben wir gezeigt , dass viele Schicksal bestimmenden Faktoren (zB Vsx1, Atoh7, PTF1A, Barhl2) handeln Zelle-autonomously spezifische Retina-Nerven Schicksale zu treiben; der Mangel der Genexpression führt in erster Linie zu einem Schicksal Schalter, so dass die Zellen mit Gen lebensfähig bleiben , durch Knockdown eine alternative Zellschicksal ^{4, 6, 7, 10} übernehmen. Zweitens kann eine solche Chimären-Experimente verwendet werden, um zu beurteilen, wie Wildtyp-Vorläufern verhalten, wenn sie in verschiedenen genetischen Umgebungen zu entwickeln. Zum Beispiel durch die Entwicklung von WT – Zellen zu vergleichen , die in der Regel ein Gen von Interesse (und Reporter – Transgen) in einem WT gegen manipulierte Host – Umgebung (zB Gen – Knockout / Knockdown), die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Genexpression und Zellschicksal zum Ausdruck bringen kann beurteilt werden . Der Mangel an bestimmten Neuronentypen in der Host-Umgebung, zum Beispiel, sie Wildtyp-Vorläuferverhalten nicht autonom in einer Zelle Art und Weise ist, um Bias gezeigt zu beeinflussen Richtung in das unterrepräsentierte o Differenzierungsr fehlt neuron Typen ^{4, 7, 11, 12.} Da die Netzhautneuronen in einer konservierten histogenic Reihenfolge durch die sequentiell zeitlich Expression spezifischer neuronaler Schicksal Determinante Gene (Schicksal Genexpression) ( beschrieben in ¹³⁾ geboren, haben wir diese Methoden zu zeigen , wie der Zeitpunkt des Ausdrucks Schicksal Gen in Wildtyp – Vorläufern betroffen ist, wenn eine solche Vorläufern in Retina-Host-Umgebungen mit induzierten anomale Zellzusammensetzungen zu entwickeln. Hier erläutern wir diese Ansätze als Beweis dafür , wie die Kombination aus relativ Standard und weit verbreitete Techniken , um die Prüfung des Timing des Schicksals Genexpression ermöglicht retinalen Vorläufern ⁸ in der ^{Entwicklung, 9.}

Dieses Protokoll beschreibt einen experimentellen Ansatz, Zeitraffer-Bildgebung mit der Leichtigkeit proBildung Transplantation in der ex vivo Entwicklung Zebrafischembryo einzelne mosaik markierten Zellen während der gesamten Dauer der Entwicklungs Retinogenese zu folgen. Durch das Durchführen funktioneller Genmanipulationen entweder im Wirtsembryo, Spenderembryo, beide oder keines von beiden, kann man die Zelle Autonomie der Genfunktion bewerten. Dieser Ansatz kann in jedem anderen System weitgehend auf ähnliche Forschungsfragen angepasst werden, für die die einzelnen Komponenten hier skizzierten geeignet sind.