Оценка загрязнения ДНК в образцах РНК, основанный на рибосомной ДНК
Summary
Здесь мы представляем собой протокол для отслеживания геномной ДНК (геномная ДНК) загрязнение образцов РНК. Представленный метод использует праймеры специфических для региона внутренней трансляции распорку (СТС) генов рибосомной ДНК (рДНК). Этот метод подходит для надежного и чувствительных обнаружения загрязнения ДНК в большинстве эукариот и прокариот.
Abstract
Один метод, широко используется для количественной оценки изменения выражения гена и Стенограмма распространённость — реверс транскрипция Количественная ПЦР в реальном времени (RT-ПЦР). Он обеспечивает точную, чувствительных, надежных и воспроизводимых результатов. Чувствительность и специфичность RT-ПЦР могут влиять несколько факторов. Остаточные геномной ДНК (геномная ДНК) загрязнение образцов РНК является одним из них. В анализ выражения гена усиление неспецифической из-за загрязнения геномная ДНК будет переоценить обилие Стенограмма уровней и может повлиять на результаты RT-ПЦР. Как правило, обнаруживается геномная ДНК qRT-PCR используя праймер пары отжига intergenic регионов или Интрон гена интереса. К сожалению Интрон/экзона аннотации пока не известны для всех генов от позвоночных животных, бактерий, протистов, грибов, растений и многоклеточные видов беспозвоночных.
Здесь мы представляем протокол для обнаружения загрязнения геномная ДНК на RNA образцов с помощью рибосомной ДНК (рДНК)-на основе грунтовки. Метод основан на уникальные особенности рДНК: их градиентный характер, весьма сохранение последовательности и высокой частоты в геноме. Также, как исследование уникальный набор грунтовки были разработаны на основе в регионе сохраняется рибосомной ДНК (рДНК) к семейству Poaceae. Универсальность этих пар грунт был проверен электрофорез геля агарозы и анализ кривой расплава. Хотя наш метод объясняет как рДНК based праймеры могут быть применены для анализа загрязнения геномная ДНК к семейству Poaceae, он может использоваться легко для других видов прокариот и эукариоты
Introduction
Изучение регуляцию интересные наборы генов или сигнализации сетей необходимо понимать сложные молекулярные механизмы, участвующие в биологических события1. В настоящее время ПЦР анализ является наиболее широко используется подход для ген выражение исследования, которые можно ориентировать ДНК (геном) или РНК (транскриптом) которые позволяют methylome и транскриптом анализа, соответственно. Обратная транскрипция (RT) следуют ПЦР широко используется для анализа транскриптом, что измерить уровни выражения гена в различных областях биологических исследований2. По сравнению с другие методы, такие как традиционной Северной гибридизации, ткани конкретных обнаружения через в situ гибридизация, рибонуклеаза защиты анализов (РПА) и полу RT-PCR, точность, удобство, скорость и широкий динамический диапазон на основе ПЦР анализов являются весьма замечательных3,4. Есть несколько важных факторов, которые должны быть рассмотрены для надежной количественной матричная РНК (мРНК), включая качество и количество исходного материала РНК. Кроме того усиление неспецифической, эффективность RT-ПЦР и ПЦР эффективность должны рассматриваться5,6.
Присутствие геномная ДНК является присущи проблемы во время извлечения РНК, частично, обусловлено аналогичные физические и химические свойства ДНК и РНК-7. Из-за последовательности личность геномная ДНК и комплементарной ДНК — (cDNA кДНК) производные от образцов mRNA может произойти усиление неспецифической, который будет влиять на точность результатов RT-ПЦР. Оставшиеся геномная ДНК приведет к завышению численности целевой мРНК гена выражение анализ8.
В основном неспецифичный ампликон главным образом вытекает из образование димера праймера или усиление неспецифической фон результате геномная ДНК, оба из которых может оцениваться с помощью надлежащих контрольных образцов. Такие примеры являются не шаблон управления (НПС) и не обратной транскриптазы (NRT), соответственно. Поскольку уровни загрязнения геномная ДНК в образцах, изучаются разные и чувствительность к геномная ДНК сильно отличается между анализ генов, NRT элементы управления являются обязательными для каждой выборки/пробирного пары. Хотя это существенно увеличивает стоимость и труда в РТ ПЦР профилирования исследования, эти элементы управления являются требуется7,9.
Альтернативные методы, занимающихся геномная ДНК загрязнения включают в себя использование праймера пар отжига intergenic регионов или Интрон гена интереса10, и использования грунтовки, которые обрамляют большие Интрон или охватывают Экзон экзона Джанкшен, т.е. отжиг сайтов отсутствуют в зрелой мРНК последовательности1,4. Однако еще не известны Интрон/экзона аннотации для всех генов от многих позвоночных животных, бактерий, протистов, грибов, растений и многоклеточные видов беспозвоночных. Кроме того многие эукариотических организмов имеют pseudogenes, производные от дублирования мероприятий. Кроме того конструкция праймера через интронов не гарантирует не усиление геномная ДНК. Как хроматина доступность геномной регионов DNase я меняется, рекомендуется для разработки различных грунтовка пар ориентации разные хромосомы10.
Геномы эукариот организмов может охватывать до тысячи копий рДНК генов, кодирующих рибосомальной подразделения, необходимых для формирования рибосом. Эти рДНК генов часто организуются в одно- или тандеме повторить массивы11. Полицистронная теорией (рис. 1), включая большие субъединицы (LSU) и небольшой субъединицы (SSU) транскрибируются РНК полимеразой я (РНК Поль я). Результате pre теорией обрабатываются дальнейшего устранения двух внутренних транскрибируется распорку регионах ITS1 и ITS2. Как готовой продукции, три Зрелые теорией, 17-18S рРНК (SSU), 5.8S и 25-28S рРНК (ЛГУ), созданного12. рДНК генов являются типичными представителями градиентный семьи с высоко сохранение последовательности. Они происходят с высокой частотой в геноме и потенциально присутствуют в более чем одной хромосомных расположение13. Обработку рРНК и деградации транскрибируется распорки является быстрый процесс в ядрышко. Благодаря высокой степени повторяемости соотношение геномной копии номер и обнаружению необработанных premolecules РНК является ниже по сравнению с низким копия Интрон последовательности и unspliced прекурсоров. Эти особенности делают рДНК генов, хорошо подходит для надежной и высокочувствительный обнаружения загрязнения геномная ДНК в большинстве прокариот и эукариот3.
Здесь описан Роман процедуры для обнаружения загрязнения геномная ДНК в образцах РНК. Для анализов геномная ДНК в нескольких видов Poaceae представлен набор универсальных грунты, основанный на последовательности рДНК сохраняется. Специфика и универсальность предлагаемая грунты были протестированы расплава анализа кривой с помощью ДНК как шаблон. Наш протокол применяется не только для злаках, но также легко могут быть адаптированы к другими прокариотами и эукариотами видов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ выражения гена путем количественного PCR широко применяется в последние годы. Основное преимущество этого быстрого, экономически эффективных и автоматизированных метода является его точное и точный результат. Однако получение оптимальных выгод от этих преимуществ требует четкого понимания установки параметров, используемых для ПЦР эксперимента. Чтобы получать надежный результат ПЦР анализ выражения гена, необходимо избежать неспецифических амплификации, который возникает от димера праймера или геномная ДНК загрязнение в РНК образца3,15. Ожидается, что уровни Стенограмма РНК будет переоценить под геномная ДНК загрязнение8. Здесь уникальные особенности ген рДНК считался для assay загрязнение геномная ДНК в образцах РНК.
Основные свойства рДНК, используемые в настоящем протоколе: Рибосомных генов состоят из двух ITSs, а именно ITS1 и ITS2 и три кодировки генов рРНК, 17-18, 5.8S и 25-28S Субблок12. В двух регионах ее не являются частью кодирующая последовательность рибосомальной подразделения. Они удаляются по крайней мере три ферментативную деятельность для обработки предвестником Зрелые рРНК: активности эндонуклеазы, helicase и exonuclease. Как рибосомная РНК транскрибируется как полицистронная стенограмма, основной продукт, содержащий ITSs конечно присутствует. Обработка очень быстро и занимает место в ядрышко, и обнаружению прекурсоров молекулы, содержащие ее сумма ниже предела обнаружения метода ПЦР. Поэтому когда ITS1 или ITS2 усиливается ее фланговые грунты, не усиление может быть обнаружен в образцов РНК, если загрязнение геномная ДНК присутствует. Включить до тысячи экземпляров, которые расположены в одном или тандем массивах на хромосомы11был численность рДНК генов в геноме эукариотических организмов. В этом протоколе мы предлагаем альтернативный способ, вместо NRT, для выявления загрязнения геномная ДНК, которая используется в калибровочных реакции.
Преимущества и ограничения в отношении существующих методов: НЗТ обычно используется для проверки, является ли подготовлен образец РНК чистой или загрязненной, геномная ДНК. Поскольку загрязнение геномная ДНК не распределены равномерно между различными образцами РНК, и чувствительность реакции геномная ДНК значительно затронуты гены проанализированы, NRT элементы необходимы для каждого образца/пробирного пара7,15. Это будет существенно добавить стоимость и труда при обработке многие образцы одновременно3,9. Другие альтернативные методы, описанные в литературе включают в себя использование Интрон конкретных Праймеры для обнаружения геномная ДНК, или проектирование грунты, которые обрамляют Интрон или охватывают Экзон экзона Джанкшен. Недостатки этих методов проистекают из отсутствия Интрон последовательности информации, неполной аннотации Интрон/экзона структуры и отсутствие интроны в генах или pseudogenes интерес1,4,10 . Из-за эволюции рДНК генов существуют как мультигенных и высоко сохранены гена семей. Они являются очень обильные в геноме и присутствует на различных хромосомы13. По сравнению с другими кодирования или nonconding генов, рДНК генов показывают наиболее пригодный для обнаружения загрязнения геномная ДНК. В анализе сравнительной транскриптомики, нормализации данных ПЦР рРНК толщиномером не рекомендуется для некоторых вопросов, таких, как различия в cDNA подготовка (поля грунтование против случайного hexamer грунтовки), большие различия между рРНК и мРНК в изобилии , и различные биогенеза, который может генерировать заблуждение результаты10,16. Однако проблемы, которые мы только что упомянули являются преимуществом для assay загрязнение геномная ДНК. Например в отношении выше таргетинга сайта изобилия в геноме и локализации на разные хромосомы, рДНК based праймеры значительно повысить чувствительность обнаружения геномная ДНК по сравнению с существующими методами.
Общности рДНК, основанных на другой организм: рДНК генов являются хорошо изученных генов семейства, определены в большинстве организмов. Предлагаемый метод, основанный на рДНК представляет простой, чувствительный и экономической системы для анализов загрязнение геномная ДНК, которые могут быть легко адаптированы к другими прокариотами и эукариотами организмов (протокол 2 – 5). Как пример мы продемонстрировали здесь полезность этого метода в некоторых видов Poceae (рис. 4 и 5). Используемые праймеры показывают высокий уровень переносимости на другие виды Poceae благодаря высоко сохраняется структура подразделений рДНК среди видов. Эта проблема становится еще более важной, когда достаточно геномные последовательности информации не доступен для конструкции праймера. Таким образом окаймляющие ее грунты, предназначенные для одного вида могут использоваться в смежных видов. Кроме того, 5.8S-F/R грунтовки были собраны на основании сохраняемой мотив, который показывает высокое сходство в большинстве цветковых растений14. Хотя методы секвенирования высокой пропускной способности постоянно увеличивать количество известных геномов, Экзон Интрон Аннотация большинство организмов не завершена, и поэтому это часто не позволяет разрабатывать грунты занимаемых Экзон экзона границы. Наш метод объясняет как рДНК based праймеры могут быть применены для геномная ДНК загрязнение пробирного анализа ПЦР прокариот и эукариот с целью устранения дорогим NRT контроля в каждой комбинации пробирного/грунтовка.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано генетические и сельскохозяйственной биотехнологии Института Tabarestan (ГАБИТА), Сари сельскохозяйственных наук и природных ресурсов университета (SANRU). Юниоров исследовательской группы абиотического стресса геномики финансировался IZN (междисциплинарный центр для исследования культур растений, Галле (Заале), Германия. Мы благодарим Ронда Meyer для критических чтении рукописи.
Materials
| Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K0221 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | K1631 | |
| GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
| 96 well WHT/CLR | Bio-Rad | HSP9601 | |
| Microseal B film | Bio-Rad | MJ-0558 | |
| Low tube strip CLR | Bio-Rad | TLS0801 | |
| Flat cap strips | Bio-Rad | TCS0803 | |
| NanoDrop 2000 | Peqlab | ND-2000 | |
| RNaseZAP | Ambion | 9780 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| RNase A, DNase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0523 | |
| TRIZOL Reagent | Ambion | 15596026 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BIO RAD | 1855195 | |
| PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
| Guanidine thiocyanate for molecular biology | Sigma-Aldrich | G9277 | |
| Agarose – Nucleic Acid Electrophoresis | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Boric Acid for molecular biology | AppliChem | A2940 | |
| bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
| ethidium bromide | AppliChem | A1151 | |
| Gel documentation system | BIO RAD | Gel Doc 2000 |
Riferimenti
- Bustin, S. A., Nolan, T. Pitfalls of quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. J Biomol Tech. 15 (3), 155-166 (2004).
- Gutierrez, L., Mauriat, M., Pelloux, J., Bellini, C., Van Wuytswinkel, O. Towards a systematic validation of references in real-time RT-PCR. Plant Cell. 20 (7), 1734-1735 (2008).
- Hashemi, S. H., Nematzadeh, G., Ahmadian, G., Yamchi, A., Kuhlmann, M. Identification and validation of Aeluropus littoralis reference genes for Quantitative Real-Time PCR Normalization. J Biol Res (Thessalon). 23 (1), 18 (2016).
- Bustin, S. A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J. Mol. Endocrinol. 25 (2), 169-193 (2000).
- Andersen, C. L., Jensen, J. L., Orntoft, T. F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res. 64 (15), 5245-5250 (2004).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Laurell, H., et al. Correction of RT-qPCR data for genomic DNA-derived signals with ValidPrime. Nucleic Acids Res. 40 (7), e51 (2012).
- Galiveti, C. R., Rozhdestvensky, T. S., Brosius, J., Lehrach, H., Konthur, Z. Application of housekeeping npcRNAs for quantitative expression analysis of human transcriptome by real-time PCR. RNA. 16 (2), 450-461 (2010).
- Laurell, H., et al. Correction of RT-qPCR data for genomic DNA-derived signals with ValidPrime. Nucleic Acids Res. 40, e51 (2012).
- Caldana, C., Scheible, W. R., Mueller-Roeber, B., Ruzicic, S. A quantitative RT-PCR platform for high-throughput expression profiling of 2500 rice transcription factors. Plant Methods. 3 (1), 7 (2007).
- Lawrence, R. J., Pikaard, C. S. Perspectives Chromatin Turn Ons and Turn Offs of Ribosomal RNA Genes. Cell Cycle. 3 (7), 880 (2004).
- Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
- Alvarez, I., Wendel, J. F. Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference. Mol Phylogenet Evol. 29 (3), 417-434 (2003).
- Jobes, D. V., Thien, L. B. A conserved motif in the 5.8 S ribosomal RNA (rRNA) gene is a useful diagnostic marker for plant internal transcribed spacer (ITS) sequences. Plant Mol Biol Report. 15 (4), 326-334 (1997).
- Padhi, B. K., Singh, M., Huang, N., Pelletier, G. A PCR-based approach to assess genomic DNA contamination in RNA: Application to rat RNA samples. Anal Biochem. 494, 49-51 (2016).
- Dheda, K., et al. Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR. Biotechniques. 37 (1), 112-114 (2004).
