Analyse de particules à haute résolution à partir de microscopie à électrons à l'aide d'images utilisant SPHIRE
Summary
Cet article présente un protocole pour le traitement des images cryo-EM à l'aide de la suite logicielle SPHIRE. Le présent protocole peut être appliqué pour presque tous les projets EM à part particulaire qui visent une résolution proche atomique.
Abstract
SPHIRE (SPARX pour la microscopie électronique à haute résolution) est une nouvelle suite logicielle open source et conviviale pour le traitement semi automatisé de données cryo-microscopie électronique à une seule particule (cryo-EM). Le protocole présenté ici décrit en détail comment obtenir une structure de résolution à proximité atomique à partir de films de micrographie cryo-EM en guidant les utilisateurs à travers toutes les étapes du pipeline de détermination de structure de particule unique. Ces étapes sont contrôlées à partir de la nouvelle interface utilisateur graphique SPHIRE et nécessitent une intervention minimale de l'utilisateur. En utilisant ce protocole, une structure de 3,5 Å de TcdA1, un complexe de toxine Tc de Photorhabdus luminescens , provient de seulement 9500 particules simples. Cette approche simplifiée aidera les utilisateurs débutants sans une expérience de traitement étendue et une information structurelle préalable, afin d'obtenir des modèles atomiques sans bruit et sans biais de leurs complexes macromoléculaires purifiés dans leur état natal.
Introduction
Après le développement de la technologie des détecteurs d'électrons directs, le progrès remarquable de la cryo-EM à une seule particule est en train de remodeler la biologie structurale 1 . Par rapport à la cristallographie aux rayons X, cette technique ne nécessite qu'une petite quantité de protéines sans avoir besoin de cristallisation, tout en posant moins de restrictions quant à la pureté de l'échantillon et permettant encore la détermination des structures à une résolution atomique proche. Il est important de noter que différentes compositions ou états peuvent maintenant être séparés par calcul et la détermination de la structure des différentes conformations peut être effectuée à un niveau de détail sans précédent. Récemment, des cartes de densité de molécules difficiles pourraient être produites à des résolutions permettant une construction de modèle de novo et une compréhension approfondie de leur mode d'action 2 , 3 , 4 , 5.
Une grande variété de progiciels de traitement d'image sont disponibles dans la communauté 3DEM (Microscopie électronique 3D) (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) et la plupart d'entre eux sont en développement continu. Une résolution proche atomique a été obtenue pour des protéines présentant divers poids moléculaires et symétries avec plusieurs progiciels différents, y compris EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 et SPARX 11 . Chaque paquetage nécessite un niveau d'expertise différent et offre un niveau différent d'orientation, d'automatisation et d'extensibilité des utilisateurs. En outre, alors que certains programmes fournissent des environnements complets pour faciliter toutes les étapes de l'analyse d'image, d'autres sont conçus pour optimiser des tâches spécifiques, comme le raffinement des paramètres d'alignement à partir d'un connuStructure de la distribution. Plus récemment, plusieurs plates-formes ont été développées, dont APPION 12 et SCIPION 13 , qui fournissent un pipeline de traitement unique qui intègre des approches et des protocoles à partir des différents logiciels répertoriés ci-dessus.
Pour contribuer au développement actuel de cryo-EM, SPARX a été redéveloppé dans une nouvelle plate-forme autonome et complète pour l'analyse de particules simples, appelée SPHIRE (SPARX pour Microscopie électronique à haute résolution). Afin d'accroître l'accessibilité de la technique pour les nouveaux chercheurs sur le terrain et de faire face à la grande quantité de données produites par des microscopes électroniques modernes entièrement automatisés, le pipeline de traitement a été redessiné et simplifié en introduisant un outil facile à utiliser Interface utilisateur graphique (GUI) et automatiser les étapes principales du flux de travail. En outre, de nouveaux algorithmes ont été ajoutés pour permettre une détermination de structure rapide, reproductible et automatisée à partir de crImages yo-EM. En outre, la validation par reproductibilité a été introduite afin d'éviter les artefacts communs produits lors de l'analyse de l'affinement et de l'hétérogénéité.
Bien que le programme ait été largement modifié, ses fonctionnalités principales appréciées ont été maintenues: un code open-source simple, la conception moderne orientée objet et les interfaces Python pour toutes les fonctions de base. Ainsi, il n'a pas été transformé en un programme de boîte noire, permettant aux utilisateurs d'étudier et de modifier facilement le code Python, de créer des applications supplémentaires ou de modifier le flux de travail global. Ceci est particulièrement utile pour les projets cryo-EM non standard.
Nous présentons ici un protocole pour l'obtention d'une carte de densité de résolution atomique proche des images cryo-EM utilisant la GUI de SPHIRE. Il décrit en détail toutes les étapes nécessaires pour générer une carte de densité à partir de films crus-EM de détection directe crue et ne se limite pas à un type de macromolécule particulier. Ce protocole vise principalement à guider newcDans le domaine grâce au flux de travail et fournir des informations importantes sur les étapes cruciales du traitement ainsi que sur certains pièges et obstacles éventuels. Les fonctionnalités plus avancées et les antécédents théoriques derrière SPHIRE seront décrits ailleurs.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cryo-EM à particules simples a connu un développement rapide au cours des dernières années et a fourni de nombreuses structures de résolution atomique de complexes macromoléculaires ayant une importance biologique majeure 25 . Afin de supporter le grand nombre d'utilisateurs débutants qui entrent actuellement sur le terrain, nous avons développé la plate-forme d'analyse d'image à une seule particule SPHIRE et présente ici un protocole de transit pour l'ensemble du flux de travail, y compris l'alignement des films, la sélection des particules, l'estimation CTF, le modèle initial Calcul, analyse de l'hétérogénéité en 2D et 3D, raffinement 3D haute résolution et estimation et filtrage de la résolution locale.
Le protocole décrit ici est conçu comme un petit guide pour la détermination de la structure 3D à l'aide de micrographies cryo-EM de la protéine d'intérêt et à l'aide d'outils informatiques fournis par la GUI autonome de SPHIRE.
La principale caractéristique du flux de travail est que la plupartDes procédures doivent être exécutées une seule fois, puisqu'elles s'appuient sur le concept de validation par reproductibilité 19 et ne nécessitent pas de modification des paramètres. Ce mécanisme de validation automatique est l'un des principaux avantages de SPHIRE sur d'autres logiciels, car les résultats ont tendance à être aussi objectifs que reproductibles et, surtout, être obtenus à un coût de calcul acceptable. Le pipeline fournit en outre une multitude d'informations de diagnostic pour les utilisateurs expérimentés afin de procéder à une validation et à une évaluation indépendantes avec leurs propres méthodes. Néanmoins, un utilisateur novice qui possède au moins des antécédents théoriques élémentaires dans la biologie structurale et la microscopie électronique devrait être en mesure d'obtenir des structures de résolution à proximité atomique en utilisant les données propres et les procédures automatisées de validation.
Cependant, l'obtention d'une structure de résolution à proximité atomique n'est pas toujours simple et le résultat dépendra fortement de la qualité de l'échantillon et de l'entrée datune. Pour les procédures présentées ici, on suppose qu'un nombre suffisant de films EM non alignés de haute qualité sont disponibles, leurs moyennes montrant des particules simples homogènes et aléatoires clairement discernables. En général, il n'y a aucune restriction concernant la symétrie, la taille ou la forme globale de la molécule, mais un faible poids moléculaire peut être un facteur limitant, en particulier lorsque la protéine a une forme globuleuse sans caractéristique. Habituellement, l'analyse de particules plus grandes et bien ordonnées avec une symétrie de groupe de points élevé est moins exigeante. Par conséquent, il est fortement recommandé aux utilisateurs débutants d'exécuter le protocole actuel d'abord avec un ensemble de données cryo-EM bien caractérisé. Les données du tutoriel SPHIRE (http: /sphire.mpg.de) ou l'un des ensembles de données envoyés par EMPIAR (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) avec des films bruts sont un bon point de départ .
Lors du traitement de données propres, il est très probable que certains ensembles de données ou certaines des images ne satisfassent pas certaines qualitésCritères de sélection. Dans ce contexte, en plus des contrôles automatiques de stabilité et de reproductibilité effectués par le programme pour les grandes étapes du processus, il est toujours recommandé aux utilisateurs d'inspecter visuellement les résultats à certains "points de contrôle" du protocole, surtout si la reconstruction finale N'est pas satisfaisant.
La première inspection visuelle peut être effectuée au niveau de la micrographie après l'alignement du film (Protocole étape 2 ) et l'estimation CTF (Protocole étape 3 ). Les moyennes corrigées par les mouvements résultantes devraient montrer des particules simples clairement discernables et bien séparées et leurs spectres de puissance devraient montrer des anneaux Thon isotropes clairement discernables. La fréquence spatiale à laquelle ils sont visibles définit, dans la plupart des cas, la résolution la plus élevée à laquelle la structure peut en principe être finalement déterminée. Des exemples d'une moyenne corrigée des mouvements de qualité suffisante et de son spectre de puissance sont présentés dans la section & #34; résultats représentatifs ". Les images externes qui pourraient avoir un impact négatif sur le résultat final peuvent être supprimées avec l'aide des outils de GUI d'évaluation de la dérivation et de la FCE de SPHIRE (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php).
En ce qui concerne le dépistage des particules, l'étape cruciale dans le pipeline SPHIRE est la classification 2D utilisant ISAC (Protocole étape 5.2) . Ici, l'utilisateur devrait contrôler que les moyennes de classe 2D reproductibles identifiées automatiquement par le programme adoptent une gamme d'orientations suffisantes pour couvrir quasi-uniformément l'espace angulaire. Si la qualité des moyennes de classe n'est pas satisfaisante (images bruyantes et / ou floues) et / ou le nombre de moyennes de classe reproductibles est très faible, envisagez d'améliorer la qualité de sélection automatique, d'optimiser l'imagerie de jeu de données ou la préparation d'échantillons. Dans la plupart des cas, il n'est pas possible de calculer une reconstruction fiable à partir d'un ensemble de données qui ne donne pas de bonnes moyennes de classe 2D. Exemples d'ave de classe 2D de haute qualitéLes rage sont présentés dans la section «Résultats représentatifs».
Au moins 100 moyennes de classe sont nécessaires pour obtenir un modèle 3D initial fiable utilisant RVIPER de manière automatisée (Protocole étape 6.1 ). Pour cette étape, l'utilisateur doit sélectionner les moyennes avec la plus haute qualité et inclure autant d'orientations différentes de la particule que possible. La qualité du modèle initial est essentielle pour la réussite du raffinement 3D ultérieur haute résolution.
Dans d'autres progiciels, la classification 3D est parfois effectuée pour éliminer les "mauvaises" particules 8 , 9 . Cependant, dans SPHIRE, la plupart de ces particules sont automatiquement éliminées déjà lors de la classification 2D en utilisant ISAC. Ainsi, il est recommandé d'effectuer l'étape de calcul du processus 3D intensif en calcul uniquement si la reconstruction et l'analyse de la variabilité 3D indiquent l'hétérogénéité de l'ensemble de données.
Plus important encore, l'utilisateur doit toujours examiner soigneusement les volumes 3D résultants (Protocole étape 9.3 ) et confirmer que les caractéristiques de la densité respective correspondent bien à la résolution nominale. À une résolution de <9 Å, des densités en forme de tige correspondant aux hélices α deviennent visibles. À une résolution <4,5 Å, les densités correspondant aux brins dans les feuilles β sont normalement bien séparées et les acides aminés volumineux deviennent visibles. Une carte haute résolution (<3 Å) devrait montrer des chaînes latérales clairement discernables, ce qui permet de construire un modèle atomique précis.
Les résultats obtenus à ce jour démontrent que, avec l'aide des tests de reproductibilité automatisés de SPHIRE et des inspections visuelles minimales, le présent protocole s'applique généralement à tout type de projet cryo-EM à part unique. Des résultats représentatifs de chaque étape de traitement sont montrés pour la reconstruction de la toxine TcdA1 dePhotorhabdus luminescens 21 , qui a été résolu à une résolution atomique proche. Des cartes de densité de qualité similaire peuvent être utilisées pour construire des modèles atomiques fiables par le tracé de squelette de novo ainsi que par un raffinement réciproque ou réel, et constituent donc un cadre structurel solide pour la compréhension de mécanismes moléculaires complexes.
CODES D'ACCESION:
Les coordonnées de la structure EM et des films non transformés ont été déposées dans la banque de données de microscopie électronique et les archives d'images de pilote de microscopie électronique sous les numéros d'accès EMD-3645 et EMPIAR-10089, respectivement.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions D. Roderer de nous avoir fourni des micrographies TcdA1. Nous remercions Steve Ludtke pour son soutien continu de l'infrastructure EMAN2. Ce travail a été soutenu par des fonds de la Max Planck Society (à SR) et du Conseil européen dans le cadre du septième programme-cadre de l'Union européenne (7e PC / 2007-2013) (subvention n ° 615984) (à SR) et octroi des National Institutes of Santé R01 GM60635 à PAP).
Materials
| SPHIRE | Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund and Houston Medical School, Houston, Texas | http://sphire.mpg.de | |
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
| Unblur | Janelia Farm Research Campus, Ashburn | http://grigoriefflab.janelia.org/unblur | |
| Coot | MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge | http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
| EMAN2 | Baylor College of Medicine, Houston | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | |
| Computing Cluster with 1824 cores | Max Planck Institute of Molecular Physiology | Linux Cluster with 76 nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM | |
| TITAN KRIOS electron microscope | FEI | 300 kV, Cs correction, XFEG | |
| Falcon II direct electron detector | FEI | ||
| EPU (automated data acquisition software) | FEI | https://www.fei.com/software/epu/ |
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