炎症性細胞の浸潤を分析するための肺胞の気管支肺胞洗浄

この研究に記載されているすべての動物実験は、全国的（ベルギーの法律14/08/1986および22/12/2003、ベルギーの勅令06/04/2010）および欧州の法律（EU指令2010/63 / EUおよび86 / 609 / EEC）。マウスおよびすべての動物プロトコールに関するすべての実験は、ゲント大学の倫理委員会（許可番号LA1400091およびEC2016-027）によって承認された。 1.準備洗浄液 100μMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含む平衡塩類溶液を調製する。 注：BAL液中のタンパク質レベルを測定するには、プロテアーゼ阻害剤を添加してBAL液中のプロテアーゼ活性を防ぐことが推奨されます。 カテーテル透明プラスチックポリエチレン21Gチューブ（内径：0.58mm、外径：0.965mm、長さ：0.5cm）に23G針を挿入してカテーテルを作製する。プレマイドカテーテルも使用することができる。 麻酔エリック末期麻酔薬、好ましくは呼吸停止を引き起こすもの（ 例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中のペントバルビタールナトリウム（> 100mg / kg）溶液などのバルビツレート）を準備する。 注：吸入麻酔はBAL液量に影響を与える可能性があるため、吸入麻酔の代わりに注射麻酔を使用することをお勧めします。例えば、CO 2は、血液のpHに影響を及ぼし、結果的に異なる化合物12の再分布に影響を及ぼす。 塩化アンモニウム – カリウム（ACK）赤血球溶解緩衝液 100μMのEDTAを含む1LのH 2 O中に8.29gのNH 4 Clおよび1gのKHCO 3を溶解することによってACK溶解緩衝液を調製する;赤血球溶解緩衝液はまた、外部供給源から購入することもできる。 2.気管支肺胞洗浄（BAL）の実施気管にカテーテルを導入する致死量の短時間作用性バルビツール酸麻酔剤を26Gの針を用いて腹腔内注射することによりマウスを安楽死させる。適切な致死麻酔を確認するには、足の反射をチェックするために鉗子でマウスの後ろ足をはさみます。 外科用プレート上の動物をその背中に置き、四肢を固定することによってマウスを固定する。 滅菌するために首に70％エタノールをスプレーします。メスを使用して気管の近くの首の皮膚に切開を作る。 皮膚を開いて唾液腺を露出させる。ピンチャーを使って胸骨弓筋を露出させて唾液腺を分ける。気管を露出させるためにピンチャーを使用して気管の周りの筋肉を切開する。 気管の下に綿棒をピンチャーで置きます。 2本の軟骨リングの間にある露出した気管の中央を26Gの針で慎重に穿刺する。気管に損傷を与えないように注意してください。 気管に約0.5cmのカテーテルを挿入します。カテーテルが確実にこれは、肺の構造物の損傷につながることができますようTERは、あまりにも遠くダウン気管に挿入されていません。 ステップ2.1.5に配置された木綿糸を用いてカテーテルの周囲に気管を結ぶことにより、カテーテルを安定させます。カテーテルが十分に結び付けられていない場合、注入された平衡塩溶液の代わりにダウン肺への気道の上部に向かって流れることができます。 洗浄液を収集 100μMEDTA滅菌平衡塩類溶液の1mLで1 mLシリンジをロードします。 カテーテルに1mLのシリンジを接続し、穏やかに肺に塩/ EDTA溶液を注入します。 マウスの胸部をマッサージしながら溶液を穏やかに吸引します。吸引液を注射器に表示されていない場合は、慎重にさらに少しダウンしているか、気管までカテーテルを挿入します。 針から注射器を除去し、氷上に置いた15 mLチューブに回収洗浄液を移します。通常、700から900＆＃181; BALのLは、注入溶液1mLから回収されます。 二回以上2.2.4 – を繰り返して、2.2.1を繰り返します。 注：目的は、非細胞コンテンツを分析することであるならば、それは感度に問題がある時にプールされたサンプルを集中することをお勧めします。 3. BAL液の細胞および非細胞コンポーネントの収集遠心分離機400×gで、4℃で7分間の洗浄液。 上清を収集し、すぐにさらなる分析（ 例えば、ELISA）のためにそれを使用するか、または-80℃で凍結します。肺の細胞流入を分析するために、細胞ペレットを保管してください。 ACK溶解緩衝液200μLで細胞ペレットを再懸濁。 注：完全な白血球細胞を維持しながら、このステップでは、赤血球の溶解を確実にします。 RTで2分間インキュベートします。 注：赤血球溶解による変動を減らすために、このステップはより長く2分間行ってはいけません。 </LI> ACK溶解緩衝液を希釈するために冷PBSを1ml加えます。 400×gで4℃で7分間遠心します。上清を捨て、下流分析（下記参照）のためのPBSの十分な容積中で細胞を再懸濁します。 注：PBSのボリュームが実行される下流の研究に依存しています。 フローサイトメトリーによるBAL液中の異なる細胞型の4分析注：一つの可能​​性は、フローサイトメトリーを行うことにより、BAL液の絶対的および相対的細胞組成を分析することです。本稿の目的は、BALの技術を詳しく説明することです。フローサイトメトリーは、独自の専門的な技術です。フローサイトメトリー法13、14、15、16、17上の専門論文を読むことが推奨されます。フルオロフォアトンに結合する抗体帽子は、使用される特定の細胞型（単数または複数）に特異的な表面抗原を（ 表1参照 ）を認識する。ゲーティング戦略を用いることにより、BALの細胞画分においてT細胞、マクロファージ、樹状細胞、B細胞、好酸球、および好中球を同定することが可能です。 抗原 セルタイプ 分化3のクラスター（CD3） T細胞上に発現分化11cのクラスタ（のCD11c） ほとんどの樹状細胞上の、だけでなく、単球、マクロファージ、好中球、および一部のB細胞に高発現。 分化11B（のCD11b）のクラスタ単球、好中球、ナチュラルキラー細胞、顆粒球およびマクロファージを含む多くの白血球の表面に発現。 SiglecF A肺胞マクロファージおよび好酸球を含む。 MHCII 通常、樹状細胞、単核食細胞およびB細胞のような抗原提示細胞上にのみ見出される。 CD19 Bリンパ球抗原 Ly-6G 単球、顆粒球および好中球のマーカー 表1：免疫細胞表面抗原の選択。この表は、異なる細胞型を特徴付けるために使用される表面エピトープのリストを提供する。特定の細胞タイプを確実に定義するには、いくつかのマーカーの組み合わせが必要です。 サンプル チューブ 細胞に添加される抗原 – フルオロフォア </td> 抗体ストック濃度（mg / mL） 抗体希釈 総量（μL） 固定可能な生存能力染料 0.2 1/1000 50 CD11c 0.2 1/800 50 シグレックF 0.2 1/100 50 サンプルX MHCII 0.2 1/200 50 CD3 0.2 1/200 50 CD19 0.2 1/200 50 CD11b 0.2 1/200 50 Ly6G 0.2 1/200 50 電圧制御 </強いです> チューブ 細胞に添加する抗原蛍光団 抗体ストック濃度（mg / mL） 抗体希釈 トータルボリューム（μL） 非染色細胞 / / / 50 シングル染色された細胞修正可能生存可能性色素 0.2 1/1000 50 シングル染色された細胞 CD11c 0.2 1/800 50 シングル染色された細胞 SiglecF 0.2 1/100 50 シングル染色された細胞 MHCII 0.2 1/200 50 シングル染色された細胞 CD3 00.2 1/200 50 シングル染色された細胞 CD19 0.2 1/200 50 シングル染色された細胞 CD11bを 0.2 1/200 50 シングル染色された細胞 Ly6G 0.2 1/200 50 報酬コントロール チューブ 抗原-フルオロフォアはビーズに追加します 抗体ストック濃度（mg / mL） 抗体希釈 トータルボリューム（μL） 染色されていないビーズ / / / 200 シングルステンドビーズ CD11c 0.2 1/2000 200 </TD> シングルステンドビーズ SiglecF 0.2 1/2000 200 シングルステンドビーズ MHCII 0.2 1/200 200 シングルステンドビーズ CD3 0.2 1/2000 200 シングルステンドビーズ CD19 0.2 1/2000 200 シングルステンドビーズ CD11bを 0.2 1/400 200 シングルステンドビーズ Ly6G 0.2 1/200 200 コントロールの表2のリストが含まれます。この表は、得られた結果の正確な解釈のために必要なすべてのコントロールを示します。 細胞表面染色注：それはIMPOですフローサイトメトリー分析のために、すべての重要なコントロールを含めることrtant。チューブ3組を（ 表2を参照）に必要とされる：（1）サンプルを含むチューブ。 （2）単一の染色を行うために、各抗体 – フルオロフォアのためのBAL細胞とチューブ。これは、フローサイトメーター上の各チャンネルの電圧の決意を可能にします。単一の汚れを作るために、各抗体 – フルオロフォアのためのビーズと、（3）チューブ。これは、補償行列を決定することです。 （ 表2を参照）は、適切な希釈でPBS中の抗体およびFcブロック（抗CD16 / CD32）のミックスを作ります。実験前に各抗体の最適な希釈率を決定する必要があります。 サンプルのための抗体混合物の50μLで細胞を再懸濁し、重要なコントロールに適切に希釈した抗体の50μLを追加します。 注：染色は、96ウェルU字状のプレートで行うことができます。これは、簡単に汚れボリュームAを削減することが可能となりますNDサンプルを大量に実行します。 4℃で暗所で30分間インキュベートします。 400×gで4℃で7分間遠心します。上清を捨てます。 200μLの最終容量までPBS中で細胞を再懸濁します。 注：この最終容量は、フローサイトメーターは、アクセスすることができ、最小限のボリュームに依存します。これは、マシン間で若干異なることができます。また、読み取りボリュームは、細胞および/またはサンプルは、フローサイトメーターで実行するのに要する時間の数によって異なります。 フローサイトメトリー分析のためのサンプルとコントロールを使用してください。 注：異なる細胞集団の絶対細胞数を決定するために、計数ビーズが添加されるべきです。測定直前に各サンプルにビーズの数が同じ（25,000ビーズを±）を追加します。フォワード使用および側方散乱によって、計数ビーズ（ 図1参照 ）、フローサイトメトリーによって同定することができます。続いて、試料中の細胞の絶対数は、thを比較することによって計算することができます。ビーズ事象と細胞事象との比。次の式を使用できます。 フローサイトメトリー分析注：フローサイトメトリー分析は、染色プロトコールの完了直後に行う必要があります。シグナル検出用の適切なレーザーとフィルターを備えたフローサイトメーターを使用する必要があります。 表3は、この原稿で説明した研究に必要なレーザーとフィルターの概要を示しています。フローサイトメトリー分析の詳細については、Adan et al。 18 。 デブリとダブレットを除いて、前方散乱とサイド散乱に基づいて1次ゲートを設定します（ 図1参照）。 単一染色された細胞とビーズの助けを借りて、スペクトル重なりの電圧と補償を調整します。 注：これらの設定は各フローサイトメーターごとに異なり、すべての実験の前に確認する必要があります。 Fまたは正確な流れ解析を行うためには、前方および側方散乱電圧が重要である。正確な前方散乱および側方散乱は、分析された細胞の同定および確認に役立ち得る。これらの電圧を測定するには、染色されていないサンプルを先に実行する必要があります。 表面抗原の蛍光ゲートを設定し（ 図1参照）、サンプルを分析します。 レーザタイプ フィルタ設定 505 LP 525/50 青色（488nm） 550 LP 575/26 100mW 670 LP 685/35 750 LP 780/60 バイオレット405nm 450/50 100mW 赤色633nm 660/20 70mW 750 LP 780/60 表3：本研究で使用したフローサイトメーターのレーザーおよびフィルターの概要。