La incubación prolongado de aguda neuronal de tejidos para la Sección de Electrofisiología y calcio de imágenes
Summary
Una vez retirado del cuerpo, el tejido neuronal se ve afectada en gran medida por las condiciones ambientales, lo que lleva a una eventual degradación de los tejidos después de 6-8 h. Utilizando un método de incubación única, que sigue de cerca y regula el ambiente extracelular de los tejidos, la viabilidad del tejido se puede ampliar de manera significativa para> 24 h.
Abstract
Aguda preparaciones de tejidos neuronales, rodajas de cerebro y de la retina wholemount, por lo general sólo puede ser mantenido durante 6 – 8 h después de la disección. Esto limita el tiempo experimental, y aumenta el número de animales que se utilizan por estudio. Esta limitación específicamente impactos protocolos tales como imágenes de calcio que requieren pre-incubación prolongada con tintes de baño-aplicado. crecimiento bacteriano exponencial dentro de 3 – 4 h después de cortar está estrechamente correlacionada con una disminución de la salud de los tejidos. Este estudio describe un método para limitar la proliferación de bacterias en preparaciones agudas para mantener el tejido neuronal viable durante periodos prolongados de tiempo (> 24 h) sin la necesidad de antibióticos, los procedimientos estériles, o medios de cultivo de tejidos que contienen factores de crecimiento. Ciclando el fluido extracelular a través de la irradiación UV y mantener el tejido en una cámara de retención de encargo en 15 – 16 ° C, el tejido no muestra diferencias en las propiedades electrofisiológicas, o si calciognaling a través de colorantes de calcio intracelular en> 24 h postdissection. Estos métodos no sólo extender el tiempo experimental para aquellos que utilizan tejido neuronal aguda, pero se reducirá el número de animales necesarios para completar objetivos experimentales, y establecerá un estándar de oro para la incubación del tejido neuronal aguda.
Introduction
Electrofisiología y la imagen funcional (calcio, colorantes sensibles al voltaje) son dos de las técnicas experimentales más utilizados en la neurociencia. preparaciones de cortes de cerebro y de la retina wholemount, que será examinada aquí, proporcionan un medio de examinar las propiedades electrofisiológicas y conectividad sináptica y sin contaminación de anestésicos o relajantes musculares. Rodajas de cerebro y de la retina wholemount mantienen su integridad estructural, a diferencia de las culturas o los homogeneizados celulares, permitiendo el estudio de los circuitos cerebrales específicos y redes 1. Las grabaciones de tejido aislado tienen ventajas sobre las grabaciones en vivo como los movimientos asociados con el latido del corazón y la respiración se eliminan. Por otra parte, la visualización directa permite que las clases específicas de células para ser dirigidos, y la aplicación local de herramientas farmacológicas 2, 3.
patch-clamp grabaciones y Calcio tinte de carga en wholemount retina se complica por la existencia de la membrana limitante interna (ILM), que cubre la capa de células ganglionares de la retina (RGC) e impide el acceso directo a las células. Típicamente, esta membrana se raspa con una pipeta de vidrio para permitir la aplicación directa de una pipeta de parche y la formación de un sello gigaohmio en una sola célula. Además, los colorantes de calcio de baño aplicado no cruzan la ILM y, o bien deben ser inyectados debajo de esta membrana 4, retrógradamente transportado después de la inyección en el nervio óptico 5 o electroporación a través del tejido 6. Por otra parte, cuando se utiliza un modelo de roedor de la retinitis pigmentosa, el ratón rd / rd, la ILM es más gruesa y más impenetrable. Aquí, nosotros usamos una técnica para eliminar la ILM con la digestión enzimática 7, para permitir tanto ubicua de calcio colorante de carga, y el acceso directo a las células ganglionares de la retina para recordi patch-clampNGS 8.
grabaciones de éxito de cualquiera de las secciones de cerebro o de la retina wholemount dependen de la disección y la incubación del tejido neuronal viable. Típicamente, el tejido se extrae en la mañana del experimento y se incubó en fluido cerebroespinal artificial (ACSF) hasta que se utiliza para las grabaciones. Por lo general, el tejido sigue siendo viable durante 6 – 8 h, con una degradación significativa después de esta ventana de tiempo. Sin embargo, ambas secciones de cerebro y preparados retinae wholemount suelen producir más tejido que puede ser grabado desde dentro de este período de tiempo corto. En consecuencia, el tejido a menudo se desecha al final del día y la disección se completa de nuevo en días posteriores. Esto significa otro animal y se utiliza ~ 2 h de la configuración y la disección / tinción repetida. El siguiente protocolo describe un método para extender la vida de tejido neuronal durante más de 24 h, lo que significa un menor número de animales se utilizan, y el tiempo más experimental está disponible. Viabilidad del tejido wcomo se evaluó a través de la grabación de las propiedades electrofisiológicas y la dinámica del calcio, y estas propiedades eran indistinguibles entre <4 hy> 24 h postdissection.
Estos resultados indican que no sólo tienen una propiedad de una sola célula intacta y funcional después de una incubación prolongada, pero la actividad de la red, según la evaluación de calcio de imágenes y registros electrofisiológicos, es sin cambios> 24 h postdissection. Por otra parte, se muestra que los colorantes de calcio pueden permanecer en las células durante períodos prolongados sin causar efectos perjudiciales. La aplicación de este protocolo demuestra que la actividad funcional de las neuronas en el tejido neuronal aguda puede mantenerse durante largos períodos de tiempo, una vez que el entorno externo es altamente regulado. Además, como la viabilidad del tejido varía mucho entre laboratorios debido a diferentes protocolos de incubación, este método establece un estándar de oro para los parámetros ideales que se deben aplicar para reducir la variabilidad en la salud de neu agudaRonal tejido.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo describe un método de incubación de extender la viabilidad del tejido neuronal aguda para los experimentos de formación de imágenes y electrofisiológicos, reduciendo así el número de animales necesarios para completar objetivos experimentales. Dos procesos principales gobiernan el deterioro del tejido neuronal a través del tiempo: i) el aumento de los niveles de bacterias, y el consiguiente aumento de la endotoxina bacteriana liberado, y ii) la excitotoxicidad que sigue el procedimiento de corte t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).
Materials
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich VETEC | V800372 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | |
| Papain Dissociation System | Worthington | LK003150 | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Pluronic F-127 Low UV absorbance* | Life technologies | P-6867 | 20% solution in DMSO |
| Fura-2 AM | Anaspec | 84017 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F23917 | |
| Fluo-8 AM | Abcam | Ab142773 | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystem | VT1200 S | Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device |
| Antivibration table | Kinetic Systems Vibraplane | Vibraplane 9100/9200 | |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Microscope Objective | Olympus | XLUMPlanFLN 20x/1.00w | 20X |
| Microscope Objective | Olympus | LUMPlanFLN 60x/1.00w | 60X |
| CCD Camera | Andor | Ixon + | |
| High speed wavelength switcher | Sutter instrument | Lambda DG-4 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instrument Co | BF150-86-10 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-40LP | Low Profile Open Bath Chambers |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Andor iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 | |
| Braincubator | Payo Scientific | BR26021976 | www.braincubator.com.au |
| Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler | TE Technology | CP-121 | |
| Temperature Controller | TE Technology | TC-36-25 RS232 |
Riferimenti
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, 117-125 (2006).
- Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
- Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3. Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).
- Blankenship, A. G., et al. Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves. Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).
- Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J Vis Exp. (92), e51396 (2014).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina. J Vis Exp. (99), e52588 (2015).
- Velte, T. J., Masland, R. H. Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells. J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).
- Cameron, M., et al. Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
- Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Breen, P. P., Buskila, Y. Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology. Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).
- Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , (2015).
- Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Sci Rep. 4, 4-10 (2014).
- Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices. Glia. 52 (3), 169-176 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).
- Buskila, Y., et al. Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse. PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
