Rilevamento e l'arricchimento di Rare antigene-specifiche cellule B per l'analisi del fenotipo e funzione

Diluizione limite analisi di frequenza precursore cellule che secernono anticorpi hanno suggerito che le cellule B reattive ad un particolare antigene tipicamente si verificano ad una frequenza da 0,05 a 0,005% nel repertorio normale, a seconda dello stato di vaccinazione e dimensione / numero di epitopi presenti sul antigene. La bassa frequenza di queste cellule ha reso difficile per studiare i cambiamenti della loro situazione durante lo sviluppo di risposte immunitarie, ad esempio dopo la vaccinazione o l'esposizione ad un antigene estraneo, o durante lo sviluppo di autoimmunità. In precedenza, i ricercatori hanno intrapreso isolamento delle cellule B antigene-reattiva utilizzando tecniche che variano da piastre rivestite con antigene o adsorbenti colonne, per l'antigene rivestite riarmo globuli rossi, alla cella di smistamento ^{1, 2, 3, 4, 5, 6} fluorescenza attivato. though queste tecniche sono riusciti ad identificare e isolare cellule B antigene-reattiva, i risultati hanno variato in termini di resa, purezza e scalabilità. Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo metodo per rilevare sia e arricchire rari sottopopolazioni di linfociti B utilizzando nanoparticelle magnetiche. Il metodo consente di arricchimento relativamente elevata resa e purezza da grandi popolazioni di partenza, ed è compatibile con l'analisi di risposte alla antigene. Arricchendo da popolazioni di cellule in sospensione, il metodo elimina vincoli associati con la geometria delle lastre o colonne antigene rivestite e produttività limite. Infine, poiché le cellule arricchiti rimangono associate antigene e un reporter fluorescente, possono essere ulteriormente purificati mediante FACS ordinamento. Come descritto qui abbiamo usato questo approccio per lo studio delle cellule B periferiche tetano sangue tetanico-reattiva, prima e dopo l'immunizzazione di soggetti umani, così come le cellule B autoantigenici-reattiva da soggetti con varie autoidisturbi mmune, tra cui diabete di tipo 1, malattia di Graves ', e la malattia di Hashimoto ^7. Il metodo funziona ugualmente bene in topo e umano, ed è compatibile con l'analisi di cellule B antigene-reattiva da una varietà di tessuti (manoscritto in preparazione).

Nel suo formato di base, cellule mononucleate del sangue periferico vengono prima incubate con l'antigene biotinilato con anticorpi di cella antigeni di superficie richiesti per l'analisi fenotipica. Questa fase di etichettatura è seguita da lavaggio e fissaggio, e l'aggiunta di streptavidina accoppiata al colorante rosso lontano fluorescente per il rilevamento della cellule vincolante biotinilato-antigene (Figura 1). Precedenti studi hanno identificato cellule B antigene-specifiche in modo simile, ma utilizzando antigeni direttamente coniugato ad un fluorocromo ^{8, 9, 10, 11.} Anche se questo è un degnoapproccio, l'uso di antigeni biotinilati in combinazione con streptavidina consente una maggiore amplificazione del segnale (quindi una migliore differenziazione delle cellule vincolanti e non vincolanti), in particolare quando gli antigeni sono piccole ^{12, 13, 14.} Un'ulteriore considerazione è l'uso di streptavidina invece di avidina perché streptavidina è deglicosilata, diminuendo legame non specifico. Inoltre, usiamo colorante far-rosso fluorescente come il fluorocromo a causa della sua fotostabilità, rendimento quantico (luminosità), e le sue piccole dimensioni (~ 1,3 KD). Fluorocromi proteine come ficoeritrina (~ 250 kD) e allophycocyanin (~ 105 kD) ¹⁵ non sono ottimali perché contengono potenzialmente molti epitopi antigenici. Uso di un piccolo colorante fluorescente biologico composto di un singolo epitopo, come colorante rosso lontano fluorescente, riduce la complessità della popolazione di cellule isolate.

Una volta che le cellule sono biotinilati-antigen e adsorbito lontano-rosso-colorante fluorescente-streptavidina, sono arricchiti con anti-far-rosso-fluorescenti nanoparticelle magnetiche colorante coniugato. Nanoparticelle singole non vengono rilevati dalla maggior parte dei citometri a flusso e quindi non devono essere rimossi prima di purificazione per FACS ordinamento e saggi a valle ^16. Selezione magnetico per cellule B antigene-specifiche arricchisce la popolazione di interesse, eliminando i tempi ei costi di classificare gli eventi rari usando un citometro a flusso.

Qui di seguito vi mostriamo i risultati rappresentativi di arricchimento delle cellule B-specifici tetano-tetanico un soggetto prima e sette giorni dopo tetano richiamo di immunizzazione. Abbiamo scelto questa particolare applicazione come esempio per dimostrare la capacità di questo metodo per arricchire cellule B antigene-specifiche seguenti acuta nella stimolazione vivo. Una volta accoppiato con citometria a flusso, questo metodo è in grado di arricchire e differenziare antigene-specifica naive, la memoria, ecellule plasmablast B e consente al ricercatore di seguire i cambiamenti nella loro frequenza nel corso del tempo. Inoltre, includiamo un'altra possibile test a valle, ad esempio, un saggio ELISPOT, il che dimostra che le cellule mantengono la capacità di secernere anticorpi a seguito di arricchimento. Un'altra applicazione di questo metodo potrebbe comportare il trasferimento adottivo di cellule arricchite in un ospite. Abbiamo precedentemente dimostrato cellule mantengono la capacità di agire come cellule presentanti l'antigene alle cellule T antigene-specifiche seguenti isolamento e di trasferimento (dati non riportati). Quindi, ci sono una serie di possibili saggi a valle che potrebbero essere accoppiati al metodo, che informa insieme la comprensione della risposta immunitaria antigene-specifica. Abbiamo descritto il metodo di seguito, inclusi i controlli per determinare la resa complessiva, la purezza, la specificità delle cellule, e piegare-arricchimento.