JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

Физиологический Получение волосковых клеток из саккулюс американского Bullfrog (<em> Рана catesbeiana</em>)

Published: March 17, 2017
doi:
10.3791/55380
,
1Laboratory of Sensory Neuroscience,The Rockefeller University

Summary

(Rana catesbeiana) саккулюс Американского Bullfrog в позволяет прямое исследование волос клеточной физиологии. Здесь Вскрытие и подготовка саккулюса в Bullfrog для биофизических исследований описана. Мы показываем репрезентативные эксперименты из этих волосковых клеток, в том числе при расчете соотношения сила-смещение пачкой и измерения его движения непринужденно.

Abstract

Исследование слуха и равновесия опирается на идеи взяты из биофизических исследований модельных систем. Одной из таких моделей, саккулюс американской лягушки, стала основой слухового и вестибулярного исследований. Исследования этого органа выявили, как волосковых клеток могут активно обнаруживать сигналы из окружающей среды. Из-за этих исследований, мы теперь лучше понять механическую селекцию и локализацию каналов трансдукции волоса клеточных, роль кальция в механической адаптации, а также идентичность волосковых клеток токов. Это очень доступный орган продолжает обеспечивать понимание работой волосковых клеток. Здесь мы опишем подготовку саккулюса в Bullfrog для биофизических исследований по его волосковых клеток. Мы включаем полную процедуру рассечение и предоставить конкретные протоколы для подготовки саккулюса в конкретных контекстах. Мы дополнительно включать репрезентативные результаты, используя этот препарат, в том числе при расчетемгновенное отношение силы смещения для волос расслоение и измерение спонтанного колебания пачкой в.

Introduction

В acousticolateralis органы млекопитающих обладают сложной архитектурой и лежат в пределах анатомической нишу, которая может быть трудно получить доступ. Например, улитка млекопитающим включает спиралевидную лабиринту и встраивается в толстом височной кости. Выделение улитке часто вызывает механическое повреждение чувствительных клеток , лежащих внутри нее , и поэтому оказалось трудной задачей 1. Нейрофизиологи таким образом, превратились для моделирования систем, которые более легко извлечены из Sanctum уха.

Одним из таких модельных систем, саккулюс американского Bullfrog (Rana catesbeiana), на протяжении десятилетий дали обобщаемых понимание функции слухового и вестибулярных систем. Саккулюс является смешанной функции органов с сенсорными ролей в обоих низкочастотной слуха и сейсмической сенсации. Чувствительные клетки саккулюса являются его волосковые клетки, специализированные преобразователи, которые преобразуют механическую энергиюв электрические сигналы в пределах наших слуховых и вестибулярных органов. Выступающую от апикальной поверхности каждой клетки волос является механочувствительных волосы пучок, который содержит градуированную пучок увеличенной микроворсинок под названием стереоцилии. Кончики соседнего стереоцилиях соединены друг с другом нитевидных белков Кончик линии связи , которые механически затвора ионных каналов в ответ на механические стимулы 2, 3. Несмотря на то, слуховые и вестибулярные органы реагируют на различные виды раздражителей, они имеют общий механизм обнаружения. Эта общность лежит в основе многих результатов, достигнутых в волосы клеток механотрансдукции через исследований Bullfrog саккулюса. Например, активный процесс волосковых клеток был широко изучен в этом органе 4, 5, 6, 7, и пучок волос использует процесс энергоемкий , чтобы произвести механическуюРабота. Мало того, что это было показано , что волосковые клетки генерируют активную работу 6, но различные механизмы , лежащие в основе активного процесса и настройки характеристик волоса клетки были открыт через исследования acousticolateralis органов лягушки. К ним относятся активные волос расслоение моторику 8 и волосковых клеток электрического резонанса 9, 10, 11 в саккулюса и избирательность по частоте на ленте Synapse 12 волосковых клеток в амфибии сосочка.

саккулюс В Bullfrog Апелляционной к чувственным нейробиологов по многим причинам. В отличие от улитке млекопитающих, этот орган находится в пределах легкодоступном ушные капсулы. Во- вторых, клетки волос внутри этого органа может оставаться здоровым в течение нескольких часов при соответствующих условиях 13, 14. Это позволяет experimentatиона на этих клетках в течение длительных периодов времени по сравнению с их коллегами млекопитающих. В-третьих, этот орган имеет мало кривизну, что позволяет легко манипулировать. В- четвертых, каждый орган включает в тысячу или более клеток волос 15, обеспечивая и высокую пропускную способность и высокую вероятность нахождения соответствующего набора волосковых клеток для данного эксперимента. И, наконец, саккулюс в Bullfrog в легко визуализируется благодаря худобе этого органа и большого размера его волосковых клеток.

Эти свойства обеспечивают большую гибкость для изучения сенсорных клеток в саккулюса в Bullfrog в. В зависимости от рассматриваемого вопроса, один из нескольких экспериментальных препаратов могут быть получены из саккулюсом. Самый простой из них является подготовка однокамерный. Здесь саккулюс обездвижен в камере, заполненной искусственным перилимфе, физиологическом растворе натрия богатых и с высоким содержанием кальция. Этот препарат позволяет исследовать волосковых клеток течений и основных механики пучка волос, Вторая конфигурация, подготовка двухкамерный, может быть использован для изучения спонтанных движений пучков волосков. Здесь апикальная сторона волосковых клеток подвергается КАЛИЕВЫЕ и кальций-плохой физиологический раствор называют искусственным эндолимфа, в то время как базолатеральная сторона купается в искусственном перилимфе. Эти два отделения имитировать расположение в естественных условиях солончаков и обеспечить среду , которая позволяет пучки волос колебаться спонтанно.

Мы описываем в этой статье получение саккулюса в Bullfrog в биофизической изучения его волосковых клеток. Мы сначала обеспечить детальное изображение изоляции этого органа от внутреннего уха лягушки. Затем мы опишем как одно- и двухкамерные экспериментальных препаратов и включают репрезентативные результаты для каждой конфигурации.

Protocol

Заявление по этике: Все процедуры были одобрены Animal Care и использование комитета Institutional (IACUC) в Университете Рокфеллера мимо. 1. Предварительная экспериментальная Prespanparation Решения Приготовьте раствор эвгенол (2,5 г · л -1 · кг -1 лягушки). Готовят солевые растворы (таблица 1). ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки однопалатным, готовят искусственный перилимфу; для подготовки двухкамерного, готовят как искусственный перилимфу и искусственный эндолимфа. 2. Экспериментальные инструменты Получение стеклянной стимуляции волокон Сужение боросиликатного стеклянный капилляр с электродом съемника в одной линии тянуть с высокой температурой и высокой скоростью. Загрузите притянутое капилляр в соленоидным приводом съемника. Принесите кончик капилляра по отношению к нити со стеклянной бусинкине плавится на него до капиллярных контактов стеклянных бус. Включите нити, чтобы расплавить кончик капилляра в стеклянный шарик. После тонкой перемычкой стеклянных форм между капилляром и бусинки, выключите нити и примерно в то же время активировать электромагнитный съемник. Примечание: Это будет тянуть стеклянный капилляр под прямым углом к ​​его длинной оси и создать прочную волокно. Убедитесь, что диаметр волокне составляет не более 0,5 – 1 мкм, а его длина не превышает 100 – 300 мкм. Если длина волокне превышает этот размер, обрезать ее с ирисами ножницами. Используйте ножницы, которые уже скучно, чтобы не повредить рассечение инструментов. Для усиления оптический контраст, разбрызгивание пальто волокна. С помощью устройства для нанесения покрытия с распылением источника золото-палладий. Вертикально загрузки каждого волокна в устройстве для нанесения покрытия методом распыления с его коническим концом к источнику. Принесите кончик волокне на расстоянии 1 – 2 см от источника золото-палладий. Закройбормотать камеру Coater, чтобы образовать уплотнение и включите его. Многократно вымывать окружающий воздух аргоном. После продувания воздуха, снижают давление в камере до 10 Па (70 мТорр). Sputter пальто в 10 с импульсами с 10 с задержкой более чем в течение 120 секунд. Примечание: наконечник Волокно будет темнеть в течение срока действия этого протокола, если покрытие распылением имело успех. Получение резких микроэлектродов Вытяните стеклянный капилляр с внутренним нити с использованием одной линии высокого тепла тянуть. Электроды должны иметь сопротивление 100 – 300 МОм при заполнении 3 М KCl. Заполните каждый электрод 3 М KCl. Изгиб наконечник каждого электрода с microforge , чтобы сделать его перпендикулярно к апикальной поверхности волосковых клеток при установке в усилителе headstage 16. Приготовление ионофореза пипеток Вытяните стеклянный капилляр с внутреннимнити накала до 50 МОм наконечника. Заполните концентрированной растворенного вещества (например, 500 мМ сульфата гентамицина). Подготовка алюминиевой монтажной площади Вырезать 1 см х 1 см квадратный из алюминиевой фольги. Проколите фольгу в центре с кончиком Pithing стержня или другого острого предмета. Формируют перфорацию так, что он имеет круглую форму и приблизительно 1 мм в диаметре. Подготовка вакуумной смазки заполненного шприца. Извлекают поршень из шприца 5 мл. Заполните шприц со спины с вакуумной смазкой. Заменить поршень. Получение политетрафторэтилена клея аппликатора Сделайте 2 мм вдоль длинной оси врезка в конце деревянного аппликатора. Прорезь должна быть в центре аппликатора, если смотреть с торца. С острыми ножницами или лезвием бритвы, вырезать 2 мм х 4 мм прямоугольник политетрафторэтилена из листа толщиной 1 мм. </lя> Используйте лезвие для тонкой одной из мм длиной кромки 2 политетрафторэтилена прямоугольника. Начиная с середины прямоугольника, уменьшить толщину прямоугольника нарезка наружу, чтобы сформировать скос на конце прямоугольника. Вставьте политетрафторэтилена прямоугольник в деревянную аппликатора щели таким образом, что скошенная кромка обращена в противоположную от палки. Нанести 5 мин эпоксидную смолу к основанию политетрафторэтилена прямоугольника, чтобы закрепить ее на месте. Разрешить клей аппликатор для отверждения в течение 1 ч при комнатной температуре. Получение нижней части двухпалатного крепление Машина или 3D печать нижняя половина двухкамерного монтажа (дополнительный файл 2). Определить круг диаметром утоплены в 20 мм на нижней поверхности камеры. Нанесите тонкий слой эпоксидной смолы с боковыми не более 3 мм утопленной окружности. Нанесите один 18 мм круговую стекло покровное на эпоксидной смоле. Разрешить эпоксидной вылечить в течение 1час 3. Извлечение внутреннего уха органов Обезболить американский Bullfrog, поместив его в небольшом ведро с эвгенол раствора анестетика в течение 10 мин. Отрегулируйте объем раствора так, что лягушки humero-лопаточного суставов лежит чуть выше поверхности раздела жидкость-воздух. Эвтаназии наркозом Bullfrog двойным Pithing. Захватите наркозом лягушка с одним пальцем на вершине своего носа, а другой ниже челюсти и повернуть голову лягушки вперед. Быстро погрузить Pithing стержень в черепной коробки через затылочное отверстие, которое находится на средней линии между процессами затылочных лягушки. Медленно снять и повернуть стержень, пока его кончик не отходит от затылочного отверстия. Force прут каудально через позвоночный отверстий, чтобы разрушить спинной мозг. Убедитесь, что лягушка была правильно вдвойне pithed, заметив, что его нижние конечности вытянуты. Возьмитесь лягушка с большим пальцем на вершине носа и первого пальца захватывая Сошниковый зубы для улучшения стабильности. Обезглавьте лягушки путем разъединять височно-нижнечелюстного сустава на двусторонней основе, а затем резки под прямым углом к ​​оси рострокаудального. Для того, чтобы гарантировать, что органы внутреннего уха внутри черепа остаются нетронутыми, убедитесь, что разрез каудальнее как тимпаны. Использование stereodissection микроскопа, выполнить срединную линию прорезать небной ткани из сошнике зубов наиболее задней степени ткани (рис 1А). Север и ясно, с горизонтальными разрезами скальпелем любой мышц, лежащих ниже небной ткани, чтобы открыть заднюю хрящ. После удаления мышцы, наблюдать форму леденец височной хряща, образующего границу ушные капсулы. Sever колумеллой на своей точке контакта с хрящом Отическая капсулы. Многократно бреют тонкие слои этого хряща путем shalloж горизонтальные разрезы через него. Избегайте глубоких сокращений, чтобы предотвратить повреждение органов внутреннего уха. Это открывает отическую капсулу нашли в структуре леденец височной хряща (рис 1B). В слуховой капсулы являются органы внутреннего уха лягушки (рис 1C). Обрежьте заднюю и боковые края слуховой капсулы, следя за тем, чтобы не повредить органы внутреннего уха. Во время вскрытия, часто текут физиологический раствор через внутренние органы уха, чтобы гарантировать, что они остаются под водой и увлажненной. Найдите два круглых отверстий в височной кости у медиального связи хряща к средней линии. Вырезать вниз через наиболее медиальной отверстие для разрыва височной кости. Сделать второй нисходящий разрез через ушные капсулы на ее задне-боковой кромке. Удалите кусок хряща между этим и предыдущим разрезом, чтобы обеспечить доступ к органам внутреннего уха. Отделить потерять хрящ между разрезами с шагом 3.8й 3.9 и вырезать его подальше от ушные капсулы. Это действие отрывает ближайший полукруглый канал, который затем может быть использован в качестве ручки для дальнейших манипуляций. Стараясь не прикасаться к саккулюс, разъединить VIII – й черепно – мозговых нервов. Держа ампулу ближайшего полукруглого канала. Осторожно повернуть внутреннее ухо, чтобы выставить оставшиеся два полукруглых каналов. После подвергая каждый канал, разорвать его. Держа нерв или полукруглое ампулу канала, извлечь внутреннее ухо от головы и поместите его в блюдо, заполнены с охлажденным кислородом искусственного перилимфе. Удаление внутреннего уха позволяет визуализировать проходы внутри височной кости , через которую полукруглых каналов пропустили один раз (рис 1D). Примечание: Повторите эти шаги, чтобы извлечь второе ухо. 4. Подготовка однопалатный Выделение саккулюса Найдите саккулюса, идентифицируя его большой йотае масса отоконий и саккулярная нерв , который лежит на вершине его (рис 1E). Будьте осторожны, чтобы не травмировать физически саккулюса в течение следующих шагов для того, чтобы сохранить целостность мешотчатых волосковых клеток. Обрежьте полукружные каналы, чтобы сделать внутреннее ухо более маневренным. Удалите perilymphatic цистерну, перекрывающую нейронную сторону саккулюса. Сделать нежные разрезы по периметру цистерне. Затем разъединить небольшие столбы ткани, мембраны преодоления цистерне на нервной стороне саккулюса. Удалить лагены и связанное с ним нерв. Проведение саккулярной нерва, осторожно поднимите саккулюса и разрезают через тонкую мембрану otoconial мешка. Как разлив отоконии из мешочка, освободить саккулюса разрезанием по его периметру. ПРИМЕЧАНИЕ: После выделения саккулюса, остальные органы внутреннего уха могут быть сохранены при желании. Удаление саккулюсом облегчает идентификацию других структур, таких какамфибия и базилярной сосочки. Используйте ножницы или пинцет, чтобы тщательно вытрите отоконии, остающийся на саккулюса. Будьте осторожны, не прикасайтесь к саккулюс во время этого процесса. Обрежьте все оставшиеся otoconial улочке мембраны от края саккулюса. Эта мембрана имеет тенденцию придерживаться пластиковых и стеклянных поверхностей и ее устранение сводит к минимуму трудности в обращении с ткани. Осторожно течь физиологический раствор через саккулюса с помощью пипетки Пастера , чтобы удалить оставшиеся отоконии (рис 1F). Примечание: Повторите эту процедуру для второго саккулюса, которая является зеркальным отражением первой. Переваривание и монтаж Используя задний конец пипетки Пастера с его кончике сломанной, перенести изолированный sacculi в чашку Петри , содержащую 3 мл 67 мг ∙ л -1 протеазы XXIV в искусственном перилимфе. Примечание: Эта процедура протеазы переваривает ссылки привязывать каждый kinociliary шарик к ОтолитоваяМембрана, что позволяет удаление мембраны, не повреждая сенсорные пучки волос. Инкубируйте ткани в течение 30 мин при 22 ° С (или 35 мин при 21 ° C). Передача каждого переваривается саккулюсу к разворотов экспериментальной камеры и закрепить ткань с магнитными штифтами. Саккулярная макулы лежит непосредственно под отолитовой мембраны и является частью саккулюса, который содержит клетки волос. Определить его и осторожно удалите его облегающего Отолитовая мембрану с помощью тонкой ресничку, следя за тем, чтобы не коснуться саккулярной макулы. 5. Подготовка Двухкамерный Выделение саккулюса Изолировать саккулюса от органов внутреннего уха, как и в разделе 4.1. Монтаж и пищеварение Заполнить монтажный блок (Дополнительный файл 3) с искусственным перилимфе и поместить перфорированную алюминиевую фольгу на одно отверстие, используя два пятна вакуумасмазывать, чтобы удерживать его на месте и образуют слабую печать. Передача одного саккулюс в фольгу и в центре его на верхней части отверстие с макулы вниз и нервов культи вверх. Удалите физиологический раствор, окружающий саккулюс с куском скрученной ткани. Wick физиологический раствор, чтобы высушить поверхность алюминиевой площади, окружающей саккулюсу. Используйте Политэтрафторэтиленовую аппликатор для применения цианакрилатный клей для создания герметичного уплотнения вдоль границы между краем саккулюсом и алюминиевой площади. Убедитесь, что вся окружность саккулюса покрыта клеем. Примечание: Исходя слишком медленно, позволяет цианакриловый клей ползать по нервной стороне саккулюса и в конечном итоге покрыть ее. Поэтому крайне важно, чтобы выполнить эту задачу быстро. Поместите каплю физиологического раствора поверх смонтированного ткани для отверждения клея. Тонкая пленка клея может образоваться на верхней части капли физиологического раствора; удалить ее с помощью пинцета. Осторожно удалите тон фольга из монтажного блока. Флип смонтированный ткани над тем, что макулярная сторона саккулюса обращена вверх и плыть его на искусственном перилимфе заполненные чашки Петри. Добавить каплю раствора протеазы XXIV на верхней части макулы и инкубировать в течение 30 мин при 22 ° С (или 35 мин при 21 ° C). Заполните нижний канал устройства двухкамерного (Дополнительный файл 2) с перилимфе и место вакуумной смазки вокруг центральной камеры. Поместите саккулюса фольгой, установленный на нижней камере с ее поверхности, обращенной к нерву теремок. Добавить смазку по всему периметру фольги. Поместите верхнюю камеру (Supplemental файл 1) препарата на фольге, заботясь , чтобы сформировать полный уплотнение с вакуумной смазкой. Заполните верхнюю камеру с ыми искусственным эндолимфе и осторожно удалите Отолитовая мембрану с ресницах.

Representative Results

Чувствующий эпителий саккулюса в Bullfrog могут быть использованы в различных конфигурациях для исследования физиологии клеток волос. Поскольку ткань является относительно плоской, она может быть установлена ​​в обоих одно- и двухкамерных препаратов. Конфигурация однокамерный обеспечивает простую установку для электрофизиологических и микромеханических записей волосковых клеток. Препарат двухкамерный вместо имитирует как эндолимфатическом и perilymphatic отсеки на соответственно апикальных и базальных стороны волосковых клеток. Эти отсеки вместе обеспечивают физиологически соответствующую среду для изучения механотрансдукции клетками волос. Характеристики чувствительности и трансдукции волосковых клеток лежат в основе их электрический ответ на механическую стимуляцию. Для того, чтобы исследовать эти возможности, мы одновременно записываются из отдельного волоса клетки положение его расслоения ирецепторный потенциал ячейки (рисунок 2). Сначала мы прикрепили гибкий стекловолокна к kinociliary луковицы пучок волос применять импульсы силы. Затем мы измеряли смещение волосяного расслоения, используя двойного фотодиод система 2 (рис 2А). Мы одновременно приобрела потенциал волосковых клеток путем пронзая клетки с резким микроэлектрода. Мы получили кривую смещения-отклика путем построения графика ответа пикового напряжения , вызванную каждого механического стимула против соответствующего перемещения волосяного Bundle (рисунок 2В). электрический отклик на волосы ячейки насыщает как для положительности и отрицательного смещения экстремумов. Уменьшение мембранного потенциала с отрицательными шагами смещения указывает на наличие покоя внутрь механотрансдукции тока. Этот ток покоя модулируется действием Са 2+ на быстрых и медленных адаптации 17, <suр класс = "Xref"> 18, 19, 20, 21. Поведение Клетка волос зависит не только от его электрических свойств, но и от микромеханики своего сенсорного пучка волос. В конфигурации подражает двухкамерные разделения эндолимфе и перилимфе в естественных условиях, обеспечивая идеальные условия для изучения механики для волос расслоения в. В этих условиях и с отолитового мембраны удалены, пучки волос могут колебаться самопроизвольно 6. Здесь мы использовали препарат двухкамерный для оценки Микромеханика отдельных пучков. Мы зафиксировали спонтанные колебания пучка волос путем литья тень на смещения монитора двойного фотодиод (рисунок 3). Для оценки роли гентамицин аминогликозиды антибиотика на механотрансдукции, мы ионтофоретически Rele Ased гентамицин непосредственно на пачке волос (рисунок 3). Концентрация выпущенном гентамицин возрастает пропорционально току, прошедшего через микропипетки. Гентамицин подавляет колебания волоса расслоения и индуцирует статическое смещение пучка к его высокой стороне. Эти эффекты отражают роль гентамицин в качестве открытого канала блокатор, который поддерживает открытого состояния механотрансдукции каналов, блокируя их проникания поры. Электрофорез заряженных химических веществ разрешений на локализованной и количественному выброс химических веществ при различных концентрациях в отсутствии потока жидкости , вызванной механическим разрушением и, таким образом , идеально подходит для изучения механочувствительных органеллах , таких как расслоение 22 волос. Спонтанное движение волос расслоение возникает в связи с взаимодействием между адаптацией и нелинейного расслоения жесткости 7,Xref "> 8, 23, 24. Это спонтанное движение подписи активного процесса для волос Bundle, который преобразует энергию сигнала в механическую работу для преодоления вязкого сопротивления. пучки волос было показано , что они обладают нелинейным мгновенной жесткости в вестибулярной 2, слуховую 25, и боковой линии системы 26. Мы напрямую измеряли мгновенную жесткость отдельного пучка волос от саккулюса в Bullfrog (рисунок 4). Для достижения этой цели мы в сочетании кончик гибкого стекловолокна к kinociliary баллоном волос Bundle (рисунок 4A). Мы поставили силы к пучку волос путем перемещения базы волокна. Сила, действующая на расслоении волос с помощью стимулирующего волокна соответствует разнице между смещениями БАВ в волокнее и наконечник, умноженное на жесткость в волокне 2, 27. Доставка импульсов через диапазон сил показывает зависимость между силой, оказываемого на пачке и последующего перемещения Расслоение в. Наклон этой силы смещения соотношение соответствует мгновенной жесткости волосяного Bundle (рисунок 4A). Этот метод позволил нам измерить мгновенную жесткость отдельного Bundle как функцию ее прогиба (фиг.4В). Кривая мгновенная сила смещения отображает нелинейную зависимость, обнажив нелинейной жесткости пучка в диапазоне от около 20 нм вокруг своего положения покоя. За пределами этого диапазона, то пучок волосы ведет себя как Hookean материала, его жесткость линейна для больших магнитуд прогибов. Эти результаты demonstоценить универсальность Bullfrog саккулюса в изучении волос клеточной физиологии. Использование этих и других препаратов, можно исследовать механотрансдукции на нескольких этапах в передаче информации из пучка по направлению к мозгу. Рисунок 1: Препарирование Внутреннее ухо Bullfrog в. (A) Просмотр верхнего нёба в Bullfrog от его брюшной стороны позволяет идентифицировать евстахиеву трубу (круг). Боковое отражение кожи, покрывающей правую сторону верхнего неба показывает расположение внутреннего уха (пунктирным прямоугольником). (B) Удаление хряща на брюшной стороне височной кости лягушки открывает отическую капсулу (пунктирная линия). (С) показано более высокое увеличение изображения отического капсулы, в которой саккулюс, лагена, CN VIII, и SACC улар нерва могут быть легко идентифицированы. (D) Вид слуховой капсулы после удаления органов внутреннего уха показывает расположение полукружных каналов. (Е) После удаления изолированного внутреннего уха, саккулюсом, лагены и VIII – й черепного нерва (CN VIII) могут быть легко идентифицированы. (F) Выделенный саккулюс обладает короткий обрубок саккулярной нерва и отолитового мембраны , лежащей на вершине своего сенсорного эпителия. Метки соответствуют (I) саккулюсу, (II) лагена, (III) CN VIII, (IV) саккулярная нерва, и (v) отолитический мембрана. Подписи осей Р и А соответствуют соответственно задней и передней стороны. Масштабные полоски обозначают 1 см (A, B), 1 мм (C, D, E) и 400 мкм (F). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. s "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать векторный вариант этого рисунка. Рисунок 2: Смещение-ответ кривой для ячейки один волос. (А) Кончик стеклянного волокна стимула был присоединен к kinociliary луковица пучок волос и базы волокна впоследствии была вытеснена через девять дискретных шагов. Позиция Расслоение была отслеживаются на двухпроцессорной системе фотодиод, и потенциал его рецептора одновременно измеряли с помощью микроэлектрода, выход которого был пропущен через усилитель в режиме моста. Сопротивление наконечника электрода был 95 МОм и мембранный потенциал покоя сверток был -47 мВ. (B) Участок рецепторного потенциала Расслоение как функция его смещения показывает нелинейную зависимость между ответом расслоения и егодолжность. Каждая точка соответствует среднему потенциалу и среднее смещение в течение временного окна 2,5 мс, начиная 2,5 мс после начала механической стимуляции. Каждый цвет представляет собой набор временных рядов, соответствующих одному и тому же импульса смещения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать векторный вариант этого рисунка. Рисунок 3: Влияние гентамицин на спонтанную волос Bundle колебанием. Самопроизвольное движение пучка волос при подготовке двухпалатного регистрировали с использованием двойной системы фотодиод. При отсутствии ионофореза высвобождения гентамицина (0 ЧА), волосыпучок отображает симметричные колебания. По мере того как величина тока, протекающего через ионтофорезном пипетки, заполненной 500 мМ гентамицин сульфат произрастает (10 нА, 20 нА), частота волосяных-расслоением экскурсий падает в зависимости от дозы и пучок смещен в сторону его высокой кромки дольше периоды времени. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать векторный вариант этого рисунка. Рисунок 4. Вычисление Пучок волоса Мгновенное Жесткость. (A) Стимул волокна (красный) жесткости K F связан тО, kinociliary лампы (коричневый) отдельного пучка волос (желтый). Вытеснение основание волокна известного расстояния X F вызывает расслоение , чтобы переместить расстояние Х B. Разница между перемещениями волокна и связки пропорциональна сила , действующая на пучок с помощью стимула волокна, F F. Повторяя это через диапазон сил дает мгновенное отношение силы смещения (справа), наклон которой соответствует мгновенной жесткости волосяного расслоения в. (В) Отдельный пучок подвергался силой импульсов возрастающей величины и его перемещения в течение первых 50 мс после того , как импульс начала измеряли (синие точки). Здесь пучок волос отображает нелинейную мгновенную жесткость в диапазоне от приблизительно 20 нм вокруг своего положения покоя. Красная кривая соответствует приступе соотношению F = K * X – 60 * г * (1 / (1 + ехр (- г * (X – X 0) / (к B * T))) + F 0, в которой F является сила , приложенная к расслоению, X есть расслоение водоизмещению, к = 790 ± 51 мкН ∙ м -1 является расслоением постоянная жесткость , когда все каналы закрыты или открыты, г = 0,43 ± 0,04 псевдошумовой сила одной литниковой пружины, X 0 = 2 ± 1.9 нм положение сверток, на котором 50% ее каналов открыты, к B Больцмана постоянная, Т температура, а F 0 = 11,7 ± 1,3 пН является смещение силы. Подгонка обладает коэффициентом определения 0.98. Стимул волокна имели жесткость 107 мкН ∙ м -1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. эс / ftp_upload / 55380 / Figure4_v5.eps "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать векторный вариант этого рисунка. растворенное вещество Формула Вес (г / моль) Добавить в 1 л Искусственный перилимфе Искусственный эндолимфа NaCl 58,4 6,54 г 0,117 г KCl 0,149 0,149 г 8,62 г CaCl 2 ⦁ 2H 2 O 147 2 мл 1 М CaCl 2 на складе 250 мкл 1 М CaCl 2 на складе HEPES 238,3 1,19 г 1,19 г D – (+) – глюкоза 180,2 0,541 г 0. 541 г Таблица 1. Решения для препарирования и экспериментальной подготовки. Отображается в этой таблице являются рецепты для искусственного перилимфе и искусственных эндолимфе растворов, используемых в рассечение и в одно- или двухкамерными препаратов. Эти растворы должны быть доведены до рН 7,2 – 7,4 с помощью приблизительно 2 мл NaOH (перилимфой) или 2 мл KOH (эндолимфу). Осмотическое прочность следует читать примерно 230 ммоль · кг -1 вследствие неполного ионной диссоциации.

Discussion

В саккулюса в Bullfrog лежат несколько тысяч легко доступных сенсорных волосковых клеток. Здесь мы показываем добычу и подготовку саккулюса для одно- и двухкамерных записей. Эти два препарата позволяют как микромеханических и электрофизиологические исследования волосковых клеток и связанных с ними пучков. Поскольку ткань может выжить в течение нескольких часов с частой заменой окисленного физиологического раствора, эксперименты могут продолжаться в течение длительного времени. Клетки волос в этих препаратах, как правило, остаются жизнеспособными микроэлектродов записи до 6 часов после вскрытия, в то время как пучки волосков спонтанно вибрировать до 24 ч после экстракции.

Успешная добыча и монтаж саккулюса петли на преодолеваем несколько общих проблем. Во-первых, прямой контакт с апикальной поверхностью саккулярной макулы следует избегать в течение всей процедуры подготовки. Саккулярная нерв обеспечивает удобную ручку для безопасного manipuтаже саккулюса. После освобождения от остальной части органов внутреннего уха, саккулюс должны быть переданы с использованием большого диаметра пипетки, оставаясь погруженным в жидкость, чтобы избежать механических повреждений его сенсорного эпителия. Удаление отоконий от макулярной поверхности должна быть выполнена без механического повреждения волосковых клеток. Поскольку отоконии лежат непосредственно на вершине макулы, волосковые клетки могут быть повреждены в результате случайного контакта между рассечение инструментов и отолитового мембраны при удалении отоконии. Во избежание повреждения, мы рекомендуем, чтобы студенистое массу отоконий проходить в месте, далеко от макулы и удалены как единую массу. Это позволяет избежать фрагментации otoconial массы на множество кластеров, каждый из которых будет индивидуально извлекаемых. Если небольшие кластеры отоконий остаются они могут быть удалены с нежным давлением жидкости, подаваемой пипеткой Пастера. Заключительный вызов предполагает формирование герметичное уплотнение между площадью саккулюс и алюминиевой установки вподготовка двухкамерный. Используя квадрат с перфорацией достаточно мал, чтобы обеспечить перекрытие около 100 мкм между саккулюса и прилегающих к нему алюминиевых разрешений полное уплотнение ткани. Клей должен быть приведен в контакт с приблизительно 100 мкм из мешотчатой ​​ткани вокруг периметра макулы, для того, чтобы сформировать плотную герметизацию.

Концентрация свободного Ca 2+ является важным фактором при изучении волосковых клеток. Ca 2+ регулирует как быстрое и медленное приспособление, определяя тем самым кинетику механотрансдукции аппарата и характеристики явлений активного процесса волосяного Bundle, в том числе самопроизвольного движения пучка 8, 23. Эндолимфального кальция в естественных условиях присутствует в 250 мкМ, поэтому наиболее физиологически соответствующая кинетика оценивали при этой концентрации (Маунселл JHR, Р. Джейкобс, и AJ Хадспет. UnpublisHED наблюдения 16). Тем не менее, микроэлектродные записи из клеток волос требуют внешней концентрации кальция, превышающей 2 мм для надлежащей герметизации клеточной мембраны вокруг микроэлектродом. Поэтому крайне важно, чтобы использовать физиологический раствор с высоким содержанием кальция для этих экспериментов. Наконец, возможно, пожелает изучить влияние внешнего кальция при механотрансдукции с использованием различных концентраций кальция. В этих случаях, важно помнить , что концентрации кальция ниже 1 мкМ , как правило , приводят к разрыву наконечника линии связи и необратимой потере трансдукции 28.

Две экспериментальные препараты, описанные здесь, позволяют для ряда биофизических измерений на волосковых клеток. Тем не менее, дополнительные измерения могут быть сделаны с небольшими изменениями к этим препаратам. В сложенном саккулярной подготовки, пучки волос визуализируются в боковом направлении. Визуализации движения волос пучок с этой точки зрения показывает последовательную словцоиона как короткий и высокий стереоцилиях 29. Здесь саккулярная макулы сначала отделяется от основной ткани, а затем складывают вдоль оси, определяемой саккулярной нерва таким образом, что пучки волос обращены наружу и визуализируются в боковом направлении в складке. Вторая модификация, волосы-клеточная диссоциация, позволяет исследовать как расслоении волосковых клеток и его сомы. Волосковых клеток механически диссоциированы на предметное стекло для работы с изображениями и электрофизиологические записи 30. Наконец, клетки волос можно выдавливать из эпителия, следуя аналогичный протокол диссоциации, но без стадии механической диссоциации. Такая обработка приводит к волосковых клеток, которые постепенно выдавливать из эпителия, обеспечивая доступ к базолатеральной Электрофизиологические записи при минимизации механических повреждений. Эти препараты и их многочисленные модификации демонстрируют универсальность лягушки саккулюса в качестве модельной системы для биофизическихисследование волосковых клеток.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to acknowledge Dr. A. J. Hudspeth for funding and expertise in developing the preparations described in this paper. We also wish to thank Brian Fabella for creating and maintaining much of the custom equipment and software used in this protocol.

J. B. A. is supported by grant F30DC014215, J. D. S. is supported by grant F30DC013468, and both J. B. A. and J. D. S. are supported by grant T32GM07739 from the National Institutes of Health.

Materials

Common to both preparations
Stereo-dissection microscope Leica MZ6 Other sources can be used
Tricaine methanesulfonate Sigma E10521 Other sources can be used
Metal pithing rod Fine Science Tools 10140-01
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-03
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11252-20
Glass Pasteur pipette and bulb (x2) Fisher Scientific 22-042816
Fine eyelash mounted on a hypodermic needle Fisher Scientific 22-557-172
Dow-corning vacuum grease Fisher Scientific 14-635-5C
Syringe for vacuum grease Fisher Scientific 14-829-45 Other sources can be used
35 mm Petri dish (x2-3) Fisher Scientific 08-772A Other sources can be used
Micropipette puller Sutter P-97 or P-2000
120 V Solenoid puller Home-made, see parts list
Sputter coater Anatech USA Hummer 6.2
Current source for iontophoresis Axon Instruments AxoClamp 2B Other sources can be used
Piezoelectric actuator Piezosystem Jena P-150-00
Amplifier for piezoelectric actuator Piezosystem Jena ENV800
Borosilicate glass capillary World Precision Instruments 1B120F-3
Name Company Catalog Number Comments
For one-chamber preparation
Microelectrode amplifier Axon Instruments AxoClamp 2B Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously
Magnetic pins (x2) Home-made, see parts list
Open-top chamber with magnetic sheet Home-made, see parts list
Name Company Catalog Number Comments
For two-chamber preparation
Upper chamber Supplementary file 1
Troughed lower chamber Supplementary file 2
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100 Other sources can be used
Mounting block Supplementary file 3
Wooden applicator sticks Fisher Scientific 23-400-112 Other sources can be used
Teflon sheet McMaster-Carr 8545K12 For teflon applicator
Cyanoacrylate glue 3M 1469SB
Lab tissues (Kimwipes) Fisher Scientific 06-666A Other sources can be used
Gentamicin sulfate Sigma-Aldrich G1914 Other sources can be used
Quick-setting epoxy McMaster-Carr 7605A18
18 mm glass coverslips Fisher Scientific 12-546 Other sources can be used
Name Company Catalog Number Comments
Saline components
NaCl Fisher Scientific S271-3 Other sources can be used
KCl Sigma-Aldrich P4504-500G Other sources can be used
CaCl2 • 2H2O Fisher Scientific 10035-04-8 Other sources can be used
HEPES Sigma-Aldrich H3375-100G Other sources can be used
D-(+)-glucose Sigma-Aldrich G7021 Other sources can be used
Name Company Catalog Number Comments/Description
Parts lists for home-made equipment
Solenoid puller
Solenoid Guardian Electric A420-065426-00 Other sources can be used
Foot-pedal switch Linemaster T-51-SC36 Other sources can be used
Pipette holder World Precision Instruments MEH900R Other sources can be used
Coarse manipulator Narishige Group MM-3 Other sources can be used
Platinum wire Alfa Aesar 25093 Other sources can be used
Power supply Leica Z050-261 Other sources can be used
Name Company Catalog Number Comments/Description
Magnetic pins
Epoxy McMaster-Carr 7556A33 Other sources can be used
1 mm thickness aluminum McMaster-Carr 89015K45 Other sources can be used
Insect pins Fine Science Tools 26000-40 Other sources can be used
Name Company Catalog Number Comments/Description
Open-top magnetic chamber
Flexible magnetic strip McMaster-Carr 5759K75 Other sources can be used
1 mm thickness aluminum McMaster-Carr 89015K45 Other sources can be used
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3734-e3734 (2012).
  2. Howard, J., Hudspeth, A. J. Compliance of the hair bundle associated with gating of mechanoelectrical transduction channels in the bullfrog’s saccular hair cell. Neuron. 1 (3), 189-199 (1988).
  3. Jaramillo, F., Hudspeth, A. J. Localization of the hair cell’s transduction channels at the hair bundle’s top by iontophoretic application of a channel blocker. Neuron. 7 (3), 409-420 (1991).
  4. Assad, J. A., Hacohen, N., Corey, D. P. Voltage dependence of adaptation and active bundle movement in bullfrog saccular hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (8), 2918-2922 (1989).
  5. Benser, M. E., Issa, N. P., Hudspeth, A. J. Hair-bundle stiffness dominates the elastic reactance to otolithic-membrane shear. Hearing research. 68 (2), 243-252 (1993).
  6. Martin, P., Hudspeth, A. J. Active hair-bundle movements can amplify a hair cell’s response to oscillatory mechanical stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (25), 14306-14311 (1999).
  7. Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Fabella, B. A., Tobin, M., Hudspeth, A. J. Control of a hair bundle’s mechanosensory function by its mechanical load. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (9), E1000-E1009 (2015).
  8. Martin, P., Bozovic, D., Choe, Y., Hudspeth, A. J. Spontaneous Oscillation by Hair Bundles of the Bullfrog’s Sacculus. Journal of Neuroscience. 23 (11), 4533-4548 (2003).
  9. Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. The Journal of physiology. 400, 275-297 (1988).
  10. Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage-and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. The Journal of physiology. , (1988).
  11. Fisher, J. A. N., Kowalik, L., Hudspeth, A. J. Imaging electrical resonance in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1651-1656 (2011).
  12. Patel, S. H., Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Hudspeth, A. J. Frequency-selective exocytosis by ribbon synapses of hair cells in the bullfrog’s amphibian papilla. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (39), 13433-13438 (2012).
  13. Gale, J. E., Meyers, J. R., Periasamy, A., Corwin, J. T. Survival of bundleless hair cells and subsequent bundle replacement in the bullfrog’s saccule. Journal of neurobiology. 50 (2), 81-92 (2002).
  14. Hudspeth, A. J. Mechanoelectrical transduction by hair cells of the bullfrog’s sacculus. Progress in brain research. 80, 129-135 (1989).
  15. Hudspeth, A. J. Integrating the active process of hair cells with cochlear function. Nature Reviews Neuroscience. 15 (9), 600-614 (2014).
  16. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Response latency of vertebrate hair cells. Biophysical journal. 26 (3), 499-506 (1979).
  17. Cheung, E. L. M., Corey, D. P. Ca2+Changes the Force Sensitivity of the Hair-Cell Transduction Channel. Biophysical journal. 90 (1), 124-139 (2006).
  18. Choe, Y., Magnasco, M. O., Hudspeth, A. J. A model for amplification of hair-bundle motion by cyclical binding of Ca2+ to mechanoelectrical-transduction channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15321-15326 (1998).
  19. Assad, J. A., Corey, D. P. An active motor model for adaptation by vertebrate hair cells. Journal of Neuroscience. 12 (9), 3291-3309 (1992).
  20. Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. Activation and adaptation of transducer currents in turtle hair cells. The Journal of physiology. , 405-434 (1989).
  21. Howard, J., Hudspeth, A. J. Mechanical relaxation of the hair bundle mediates adaptation in mechanoelectrical transduction by the bullfrog’s saccular hair cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (9), 3064-3068 (1987).
  22. Purves, R. D. The release of drugs from iontophoretic pipettes. Journal of Theoretical Biology. 66 (4), 789-798 (1977).
  23. Tinevez, J. Y., Jülicher, F., Martin, P. Unifying the various incarnations of active hair-bundle motility by the vertebrate hair cell. Biophysical journal. 93 (11), 4053-4067 (2007).
  24. Ó Maoiléidigh, D., Nicola, E. M., Hudspeth, A. J. The diverse effects of mechanical loading on active hair bundles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (6), 1943-1948 (2012).
  25. Kennedy, H. J., Crawford, A. C., Fettiplace, R. Force generation by mammalian hair bundles supports a role in cochlear amplification. Nature. 433 (7028), 880-883 (2005).
  26. van Netten, S. M., Khanna, S. M. Stiffness changes of the cupula associated with the mechanics of hair cells in the fish lateral line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1549-1553 (1994).
  27. Bormuth, V., Barral, J., Joanny, J. F., Jülicher, F., Martin, P. Transduction channels’ gating can control friction on vibrating hair-cell bundles in the ear. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7185-7190 (2014).
  28. Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. The actions of calcium on the mechano-electrical transducer current of turtle hair cells. The Journal of physiology. , 369-398 (1991).
  29. Kozlov, A. S., Risler, T., Hudspeth, A. J. Coherent motion of stereocilia assures the concerted gating of hair-cell transduction channels. Nature Neuroscience. 10 (1), 87-92 (2007).
  30. Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Regulation of free Ca2+ concentration in hair-cell stereocilia. Journal of Neuroscience. 18 (16), 6300-6318 (1998).

Tags

Hair CellsSacculusAmerican BullfrogRana CatesbeianaSensory NeuroscienceAuditoryVestibularHair BundleMechanical StimuliInner EarDissectionOtic CapsuleTemporal CartilageColumellaSalineSemi-circular Canals

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Azimzadeh, J. B., Salvi, J. D. Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana). J. Vis. Exp. (121), e55380, doi:10.3791/55380 (2017).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image