התבגרות של האדם גזע גזע נגזר Cardiomyocytes ב ביאוירס באמצעות גירוי חשמלי
Summary
הפלטפורמה biowire הלב היא שיטה חוץ גופית המשמשת להבשיל עובריים אנושיים cardiomyocytes הנגזרות תאי גזע מושרים (hPSC-CM) על ידי שילוב טיפוח התא תלת ממדי עם גירוי חשמלי. כתב יד זה מציג את ההגדרה המפורטת של פלטפורמת biowire לב.
Abstract
גזע פלוריפוטנטיים האנוש cardiomyocytes התא נגזר (hPSC-CMS) היה מקור תא הבטיח ובכך עודד את החקירה של היישומים הפוטנציאליים שלהם במחקר לב, כוללים גילוי תרופות, דוגמנות מחלה, הנדסת רקמות, ורפואת רגנרטיבית. עם זאת, תאים המיוצרים על ידי פרוטוקולים קיימים להציג מגוון של בגרות לעומת cardiomyocytes חדרית בוגרי ילידים. מאמצים רבים נעשו כדי להבשיל hPSC-CMS, עם התבגרות מתונה בלבד שהושגה עד כה. לכן, מערכת מהונדסת, שנקראה biowire, כבר המציאה ידי מתן שני רמזים פיסיים חשמל להוביל hPSC-CMS למצב בשל יותר במבחנה. המערכת משתמשת בפלטפורמה microfabricated זרע hPSC-CMS מסוג קולגן אני ג'ל לאורך תפר תבנית נוקשה להרכיב לתוך רקמת לב מיושר (biowire), הכפופה גירוי שדה חשמלי בתדירות גוברת בהדרגה. בהשוואה לקבוצת ביקורת nonstimulated,מגורה biowired cardiomyocytes להפגין תואר משופר של התבגרות מבנית אלקטרו. שינויים כאלה הם תלויים שיעור הגירוי. כתב יד זה מתאר בפירוט את העיצוב והיצירה של biowires.
Introduction
טיפול המבוסס על תא הוא אחת האסטרטגיות המבטיחות וחקרו ביותר להשיג תיקון / התחדשות לב. הוא נוצל בעזרת הנדסת רקמות לב ואת שיתוף המשלוח של חומרים ביולוגיים 1, 2. רוב המקורות סלולריים הזמינים נחקרו במודלים של בעלי חיים עבור והשפעתם הפוטנציאלית החיובית על פגום, חולה, או לבבות בגילאי 3. בפרט, מאמצים משמעותיים נעשו להשתמש בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) -derived cardiomyocytes (hPSC-CM), מקור תא עצמי בלתי מוגבל פוטנציאלי עבור הנדסת רקמות לב. hPSC-CMS ניתן להפיק באמצעות פרוטוקולים כמה הוקמו 4, 5, 6. עם זאת, התאים המתקבלים להציג פנוטיפים העובר דמוי, עם מגוון של מאפיינים בשלה לעומת cardiomyocytes חדרית בוגרים 7, </sup> 8. זה יכול להיות מכשול בפני יישום של hPSC-CMS כמודלים של רקמת הלב המבוגר במחקר גילוי סמים בפיתוח מודלים למחלות לב מבוגר 9.
על מנת להתגבר על מגבלה זו של בגרות פנוטיפי, גישות חדשות נחקרו באופן פעיל כדי לקדם התבגרות cardiomyocyte. מחקרים מוקדמים גילו תכונות פרו-בשלות יעילות cardiomyocytes עכברוש בילוד באמצעות 10 מכנים מחזוריים או 11 גירוי חשמלי. דחיסת ג'ל גירוי מכאני מחזורי הוצגו גם לשפר היבטים מסוימים של התבגרות hPSC-CM 12, 13, עם שיפור מזערי של נכסי טיפול אלקטרו וסידן. לכן, מערכת פלטפורמה בשם "חוט ביולוגי" (biowire) תוכננה על ידי מתן שני רמזים מבניים stimulatio שדה החשמליn על מנת לשפר את ההבשלה של hPSC-CMS 14. מערכת זו משתמשת בפלטפורמת microfabricated ליצור רקמת לב מיושרת כי ניתן גירוי שדה חשמלי. זה יכול לשמש כדי לשפר את הבגרות המבנית של אלקטרו hPSC-CMS. כאן, אנו מתארים את הפרטים של מה שהופך biowires כזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה מתאר את ההתקנה והטמעה של הפלטפורמה המהונדסת, biowire, כדי לשפר את ההבשלה של hPSC-CMS. המכשיר יכול להתבצע במתקני microfabrication סטנדרטיים, biowires יכול להיות מיוצר עם טכניקות תרבית תאים משותפות לממריץ חשמלי.
למיטב ידיעתנו, אין דיווח שיטה …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי גרנט ב- סיוע מן הלב ושבץ הקרן של קנדה (G-14-0,006,265), מענקי הפעלה מהמוסד הקנדי לבריאות מחקר (137,352 ו 143,066), וכן מענק מקרן JP Bickell (1,013,821 ) ל SSN.
Materials
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4-inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
Riferimenti
- Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005 (2015).
- Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84, 85-106 (2015).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
- Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
- Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
