Farklı Olarak izotopla işaretli Kardeş histonlarla nükleozomlann Sulandırma
Summary
Bu protokol farklı şekilde izotop işaretli kardeş histon içeren nükleozom sulandırılması açıklar. Aynı zamanda, asimetrik translasyon sonrası modifiye edilmiş nükleozom bir premodified histon kopya kullandıktan sonra oluşturulabilir. Bu preparatlar kolaylıkla yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi kullanarak, her iki kız kardeş histonlar üzerinde eş zamanlı olarak, değişiklik çapraz-karışma mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.
Abstract
Asimetrik modifiye nükleozom post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) belirgin setleri ile dekore edilmiş bir histon iki kopyasını (kardeş histon) içerirler. Onlar yeni kurulması ve işlevsel etkileri bilinmeyen yollarla türler tanımlanır. Güncel analitik yöntemler nucleosomal kardeş histon üzerinde PTMS kopya özgü oluşumunu algılamak için yetersiz kalmaktadır. Bu protokol farklı şekilde izotop işaretli kardeş histon içeren nükleozom in vitro Sulandırma için bir biyokimyasal yöntem sunmaktadır. Oluşturulan kompleks, histon subcomplexes tekrar katlama esnasında premodified histon havuz sonra da asimetrik değiştirilmiş olabilir. Bu asimetrik nükleozom preparatlar kolaylıkla olarak, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi kullanılarak asimetrik ön dahil PTM tarafından uygulanan modifikasyonu çapraz konuşma ile ilgili mekanizmaların çalışılmasına histon değiştirici enzimler ile de reaksiyona sokulabilir. özellikle, modifikasyon reaksiyonlarıGerçek zamanlı, ilgili izotop türü için özel NMR korelasyon deneyleri farklı, yaparak iki kardeş histon bağımsız eşlenebilir. Bu metodoloji nucleosomal kompleksleri üzerinde asimetrik PTM desen oluşumu ve yayılımı katkıda karışma mekanizmaları incelemek için araçlar sağlar.
Introduction
Ökaryotik DNA sıkıca kromatin içine hücre çekirdeğinde içinde paketlenir. kromatin temel yapı taşı iki nüsha dört çekirdek histon her (H3, H4, H2A, H2B) oluşan bir oktamerik kompleks sarılı DNA ~ 147 bp içerir nucleosome çekirdek parçacık olduğunu. Histon proteini post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) bir bolluk barındırırlar. Bu kovalent ikameler, hem doğrudan hem de sistemin fiziksel kimya etkileyerek dolaylı kromatin remodeling faaliyetleri, 1, 2, 3 alımı ile kromatin yapısındaki değişiklikler neden olur. Bu sayede, histon PTMS Bu nedenle, tüm DNA bazlı hücresel fonksiyonları 4 düzenleyen, kromatin ulaşmak ve kontrol.
PTMS ağırlıklı nucleosome-dahil çekirdek histo yapılandırılmamış N-terminal kesimleri (kuyrukları) üzerine histon modifiye enzim sistemleri tarafından yüklenirnes. Nedeniyle histon kuyrukları nispeten kısa dizisi birçok değişiklik sitelerine, PTMS uyaran veya sonradan değişiklik reaksiyonları, modifikasyon çapraz konuşma 5 olarak bilinen bir etkisi bloke ederek birbirini etkilemektedir. Çünkü nükleozom genel simetrik mimarisi, modifikasyon reaksiyonları ve karışma mekanizmaları her nucleosomal histon (kardeş histon) iki nüsha üzerine benzer oluştuğu düşünülüyordu. Bu kavram son zamanlarda meydan ve sonradan yalanlandı. Özellikle, serbest histon H3 kuyruk peptidler ve nükleozom in vitro enzimatik deneyler, H3 kinazlar bir dizi asimetrik bir şekilde 6 fosforilasyonu ortaya olduğunu göstermiştir. Ek olarak, afinite arıtma tabanlı LC-MS / MS analizi ökaryotik hücreler 7 çeşitli tipler, asimetrik H3-metillenmiş nükleozom varlığını ortaya çıkarmıştır. Böylece, asimetrik değiştirilmiş nükleozom yeni türler oluşturur vearaçları kendi oluşumunu kontrol ve bu asimetri uygulamak olabilir karışma etkilerini analiz etmek mekanizmalarını ortaya çıkarmak için gereklidir.
Genel olarak, Western Blot (WB) ve kütle spektrometrisi (MS) analizi histon PTMS tespit etmek için kullanılmıştır. Kolay uygulama olmasına rağmen, WB özgünlüğü / çapraz reaktivite sorunlardan muzdarip. Bunun üzerine, bu aynı anda birden fazla PTM analiz ve modifikasyon reaksiyonları 8 doğrudan ölçümü gerçekleştirme yeteneğinde değildir. Öte yandan, MS analizi üst düzey eğitim gerektirir sofistike aletler kullanılır, ancak birden PTMS 9 yüksek özgüllük yanı sıra eşzamanlı haritalama ve ölçümü sağlar. Bununla birlikte, her iki yöntem de yıkıcı ve nükleozomal kompleksleri histon ve / veya histon türevi peptitlerin karışımına yol açan, analizden önce ayrışmış. Bu manipülasyon bağımsız ayırt yeteneği kaldırırİki kardeş histon her biri üzerinde meydana gelen ve nucleosomal histon kopyası özgü değişiklik durumunu bildirmek için modifikasyon reaksiyonları.
PTM tepkileri eşleştirmek için alternatif bir yöntem olarak gelişti Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) spektroskopisi. NMR, 11 yıkıcı olmayan ve bu nedenle de yeniden karışımlarında gerçek zamanlı bir şekilde PTM etkinlikleri izlenmesine olanak sağlar ve hatta, sağlam hücreler 10. 2D göre, hızlı veri toplama için rutinleri yanı sıra, yüksek çözünürlüklü eşleme geliştirme izotopla işaretli (15 N ve / veya 13 ° C) örneklerinin heteroatom nükleer korelasyon yöntemleri 12, bu PTMS farklı eşzamanlı eşleme izin serin / treonin / tirozin fosforilasyonu, lizin asetilasyon / metilasyon ve arginin metilasyonu 13 olarak. Soruşturma altında PTM bağlı olarak, 15 N veya 13 C-etiketleme protocols bir değişiklik muhabir olarak hizmet veren protein fonksiyonel grubu işaretlemek için kullanılabilir. Sonuç olarak, PTM yerleştirme araçları kimyasal madde ortamında Değişiklik "algılama" tekabül eden fonksiyonel grup karakteristik kimyasal kayma yer değiştirme izleyerek gerçekleştirilebilir. Çoğu durumda, NH ve CH kimyasal grupların her iki ilgi PTM evrimini bildirmek için kullanılabilir.
Geçerli protokol farklı şekilde izotop işaretli kardeş histon içeren nükleozom üretimini tarif. NMR spektroskopisi esnekliği seçilmiş yeniden histon komplekslerinin saflaştırılması için farklı protein afinite etiketleri kullanımı ile hem 1 H 15 N ve 1 H-13 C korelasyon spektrumları kullanılarak PTMS eşleştirmek için bir araya getirir. Bu protokol nükleozom sulandırma için belirli histon iki farklı havuzları kullanmaktadır. Bu havuzlar farklı şekilde izotop işaretli (tek ile vardır <sup> 15 N, 13 ° C, diğer), ve sırası ile bir polihistidin ve bir streptavidin afinite etiketi için eritilerek birleştirilir. Ni-NTA ve streptavidin bazlı kromatografi ile tandem afinite saflaştırma şeması, ilk Voigt ve arkadaşları tarafından kullanılır. 7 simetrik meslektaşları (Şekil 1A), asimetrik tür saflaştırmak için kullanılır. Asimetrik histon octamers standart tuz diyaliz yöntemi 14 ile eşdeğer nükleozomal kompleksleri (Şekil 1B) tekrar oluşturmak için, daha sonra kullanılır. Buna ek olarak, modifiye edilmiş önceden aynı prosedür aracılığıyla ve histon havuzları birine sahip olarak, bir PTM elde nükleozom üzerine asimetrik dahil edilebilir. Histon modifiye enzimler ve modifikasyon olayların ardından NMR-haritalama ile bu yüzeylerin reaksiyonu (her ikisi de-cis (premodified histon kopya) ve trans unmodifi karışma mekanizmalarının karakterizasyonu sağlayacaked histon kopya) (Şekil 1C).
Protocol
Representative Results
Discussion
Nucleosome yeniden oluşturulmak üzere, mevcut protokol 601-Widom nucleosome konumlandırma dizisini 20 içeren bir 165 bp uzunluğunda DNA şablonu kullanır, ancak benzer performans DNA şablonları değişik uzunluklarda kullanılarak bekleniyor. protokol histon H3 asimetrik türlerini kullanarak tasarlanmış ve kullanılmıştır. Aynı ilke ile, yöntem, diğer çekirdek histon için de uygulanabilir ve buna ek olarak farklı bir izotop etiketli iki farklı çekirdek histon taşıyan kompl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bir araştırma bursu aracılığıyla iş için fon deneyler ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) gerçekleştirmek için ıslak laboratuvar alanı ve altyapıyı sağlamak için yazar teşekkür Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlin) (LI 2402 / 2-1).
Materials
| Unfolding Buffer | 7M guanidinium HCl | ||
| 20mM Tris pH7.5 | |||
| 10mM DTT | |||
| Refolding Buffer | 10mM Tris pH7.5 | ||
| 2M NaCl | |||
| 1mM EDTA | |||
| 2mM DTT | |||
| Assay Buffer | 25mM NaxHxPO4 pH6.8 | ||
| 25mM NaCl | |||
| 2mM DTT | |||
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
| Tris | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2HPO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
| Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| Hi-Load 16/600 Superdex 200pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6-8kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
| 50kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
| 10kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe |
Riferimenti
- Hansen, J. C. Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The Biology of Chromatin Remodeling Complexes. Annu. Rev. Biochem. 78, 273-304 (2009).
- Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications. Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The Language of Histone Crosstalk. Cell. 142 (5), 682-685 (2010).
- Liokatis, S., et al. Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).
- Voigt, P., et al. Asymmetrically Modified Nucleosomes. Cell. 151 (1), 181-193 (2012).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications. Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).
- Binolfi, A., et al. Intracellular repair of oxidation-damaged α-synuclein fails to target C-terminal modification sites. Nat. Commun. 7, 10251 (2016).
- Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds. J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).
- Theillet, F. X., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA. Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).
- Artimo, P., et al. ExPASy :SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).
- Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).
- Stützer, A., et al. Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails. Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).
- Zhou, B. R., et al. Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome. J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).
- Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).
- Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).
- Bernstein, B. E., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125 (2), 315-326 (2006).
