된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성
Summary
이 프로토콜은 차등 동위 원소 표지 자매 히스톤를 포함하는 뉴 클레오의 재구성에 대해 설명합니다. 동시에, 비대칭 번역 후 개질은 뉴 클레오 히스톤 premodified 복사를 사용한 후 발생 될 수있다. 이러한 제제는 즉시 고해상도 NMR 분광법을 이용하여 두 자매 히스톤 동시에, 수정 누화 메커니즘을 연구하는데 사용될 수있다.
Abstract
비대칭으로 변형 된 뉴 클레오는 번역 후 수정 (PTMS)의 고유 한 세트로 장식 히스톤의 두 복사본 (자매 히스톤)를 포함한다. 그들은 새로 설립하고 기능적인 의미의 알 수없는 수단 종을 식별된다. 현재 분석 방법은 뉴 클레오 솜 자매 히스톤에 PTMS의 복사 특정 발생을 감지 할 불충분하다. 이 프로토콜은 차등 동위 원소 표지 자매 히스톤를 포함하는 뉴 클레오의 체외 재구성을위한 생화학 적 방법을 제시한다. 생성 된 복합체는 히스톤 서브 콤플렉스의 리 폴딩 동안 premodified 히스톤 풀을 포함 한 후,도 비대칭으로 변형 될 수있다. 이러한 비대칭 뉴 클레오 제제는 용이하게 될 핵 자기 공명 (NMR) 분광법을 사용하여 비대칭 미리 혼입 PTM에 의해 부과 된 변형 누화 메커니즘을 연구하는 히스톤 개질제 효소와 반응 할 수있다. 특히, 개질 반응실시간 각각 동위 유형에 맞는 NMR 상관 실험의 종류를 수행하여 두 자매 히스톤에 독립적으로 매핑 될 수있다. 이 방법은 뉴 클레오 솜 착체 비대칭 PTM 패턴의 형성과 증식에 기여 누화 메커니즘을 연구 할 수있는 수단을 제공한다.
Introduction
진핵 생물 DNA 단단히 염색질로 세포 핵 내에서 패키지됩니다. 염색질의 기본 빌딩 블록은 두 복사본 네 핵심 히스톤의 각 (H3, H4, H2A, H2B)들로 이루어지는 복합 octameric 감싸 DNA의 ~ 147 염기쌍을 포함하는 뉴 클레오 코어 입자이다. 히스톤 단백질 번역 후 수정 (PTMS)의 과다 항구. 이러한 공유 치환은, 직접적으로 시스템의 물리 화학적 성질에 의해 영향을 간접적 염색질 개조 활동 1, 2, 3을 채용하여 염색질 구조에서의 변화를 유도한다. 그 수단으로 히스톤 PTMS 그러므로, 모든 DNA 기반 세포 기능 4를 조절, 염색질 액세스를 제어합니다.
PTMS 주로 뉴 클레오 – 통합 코어 히스의 구조화 N- 말단 부분 (꼬리)에 히스톤 – 수정 효소 시스템으로 설치됩니다NES. 인해 히스톤 꼬리 비교적 짧은 순서에 많은 변형 사이트, PTMS는 유도 또는 후속 개질 반응, 개질 누화 (5)으로 알려진 효과를 차단하여 서로 영향을 미친다. 때문에 뉴 클레오의 전체적인 대칭 구조의, 수정 반응 및 크로스 토크 메커니즘은 각각의 뉴 클레오 솜 히스톤 (자매 히스톤)의 두 복사본에 유사하게 발생하는 것으로 생각되었다. 이 개념은 최근 도전이어서 반증되었다. 특히, 무료 히스톤 H3 꼬리 펩티드에와 뉴 클레오에 체외 효소 분석은 H3 키나제의 집합이 비대칭으로 6 인산화를 도입 있음을 보여 주었다. 또한, 친 화성 정제 기반 LC-MS / MS 분석은 진핵 세포 (7)의 여러 종류의 비대칭 H3-메틸화 뉴 클레오의 존재를 밝혔다. 따라서, 변형 된 뉴 클레오 비대칭은 신규 한 종을 구성하며도구들은 형성을 제어하고,이 비대칭 발휘할 수있는 크로스 토크 효과를 분석하기 위해 메커니즘을 밝히기 위해서 필요하다.
일반적으로, 웨스턴 블로 팅 (WB) 및 질량 분광법 (MS) 분석 히스톤 PTMS를 검출하는데 사용되어왔다. 쉬운 응용 프로그램에도 불구하고, WB는 특이 / 교차 반응의 문제를 겪고있다. 그 위에, 그것은 동시에 다중 PTM 분석 및 개질 반응 (8)의 직접적인 정량을 수행 할 수 없게된다. 한편, MS 분석은 높은 레벨 트레이닝을 필요로 복잡한 장비를 사용하지만, 다수 PTMS 9의 특이성뿐만 아니라, 동시에 매핑 및 정량화를 제공한다. 그러나, 두 방법은 중단되고 뉴 클레오 솜 복합체는 히스톤 및 / 또는 히스톤 유래 펩타이드의 혼합물을 야기하는, 분석 전에 분해된다. 이 조작은 독립적으로 구별 할 수있는 능력을 제거두 자매 히스톤 각각 발생 뉴 클레오 솜 히스톤의 복사 특정 변형 상태를보고 수정 반응.
PTM 반응을 매핑하는 다른 방법으로 진화 핵 자기 공명 (NMR) 분광법. NMR은 11 무중단되고 따라서 재구성 된 혼합물에 실시간 방식 PTM 이벤트의 모니터링을 허용하고 심지어 손상 세포 십인치 2D에 기초하여 고속 데이터 수집 루틴뿐만 아니라 고해상도 매핑 개발은 동위 원소 – 표지 (15 N 및 / 또는 13 C) 샘플 이종 핵 상관 방법 (12)은 이러한 PTMS 다른 유형의 동시 매핑을 허용 세린 / 트레오닌 / 티로신 인산화, 리신 아세틸 / 메틸화 및 메틸화 아르기닌 13. 조사 아래 PTM에 따라 15 N- 또는 13 C-라벨 홍보otocols는 변형 리포터로서 역할 단백질 관능기를 표시하기 위해 사용될 수있다. 따라서, PTM 매핑은 화학 환경에서 변화를 '검출'해당 관능기의 특성 화학 이동 변위에 따라 수행 될 수있다. 대부분의 경우, NH 및 CH 화학 그룹 모두는 관심의 PTM의 진화를보고하기 위해 사용될 수있다.
현재의 프로토콜은 차등 동위 원소 표지 자매 히스톤를 포함하는 뉴 클레오의 생성을 설명합니다. 이것은 NMR 스펙트럼의 유연성 선택된 재구성 히스톤 복합체 정화용 다른 단백질 친 화성 태그를 이용하여 모두 1 H- 15 N 1 H- 13 C 상관 스펙트럼을 사용 PTMS 매핑하는 조합. 특히, 프로토콜은 뉴 클레오 재구성에 대한 특정 히스톤의 두 개의 다른 풀을 이용한다. 이 풀은 차등 동위 원소 표지 (하나입니다 <sup> 15 N, 13 C와 다른)이 있으며, 이들은 각각 폴리 히스티딘 및 스트렙 친 화성 태그에 융합된다. 니켈 NTA와 스트렙 타비 딘 기반의 크로마토 그래피 탠덤 선호도 정화 방식은 처음 보이트 등으로 사용된다. 7 대칭 대응 (도 1a)에서 비대칭 종을 정화하는데 사용된다. 비대칭 히스톤 octamers는 표준 소금 투석 방법 (14)를 사용하여, 상응하는 뉴 클레오 솜 단지 (그림 1B)를 재구성하기 위해 연속적으로 사용된다. 또한, 변성 전 동일한 절차를 통해 히스톤 풀을 구비함으로써, PTM이 생성 뉴 클레오에 비대칭 적으로 혼입 될 수있다. 히스톤 – 수정 효소 및 수정 이벤트의 후속 NMR-매핑이 기판의 반응은 (모두 시스 (premodified 히스톤 복사)과의 트랜스 unmodifi를 크로스 토크 메커니즘의 특성을 가능하게에드 히스톤 복사) (그림 1C).
Protocol
Representative Results
Discussion
뉴 클레오 재구성 들어, 현재 프로토콜은 601 Widom 뉴 클레오 위치 결정 시퀀스 (20)를 포함하는 165 bp의 DNA 오랜 서식을 이용하지만, 유사한 성능 DNA 템플릿의 다양한 길이를 사용하는 것으로 예상된다. 프로토콜은 히스톤 H3의 비대칭 형태를 이용하여 설계하고 사용 하였다. 동일한 원리, 방법은 다른 코어 히스톤에도 적용 할 수 있고 추가로 다른 동위 원소 라벨 두 가지 핵심 히스…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구 보조금을 통해 사업 자금에 대한 실험과 독일 연구 협회 (DFG)를 수행하기 위해 습식 실험실 공간 및 인프라를 제공하는 저자 덕분에 박사 필립 Selenko (FMP-베를린) (LI 2402 / 2-1).
Materials
| Unfolding Buffer | 7M guanidinium HCl | ||
| 20mM Tris pH7.5 | |||
| 10mM DTT | |||
| Refolding Buffer | 10mM Tris pH7.5 | ||
| 2M NaCl | |||
| 1mM EDTA | |||
| 2mM DTT | |||
| Assay Buffer | 25mM NaxHxPO4 pH6.8 | ||
| 25mM NaCl | |||
| 2mM DTT | |||
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
| Tris | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2HPO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
| Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| Hi-Load 16/600 Superdex 200pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6-8kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
| 50kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
| 10kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe |
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