Reconstitution de nucléosomes avec histones soeurs Différentiellement Isotope marqués

ADN eucaryote est étroitement emballés dans les noyaux des cellules en chromatine. Le bloc de construction fondamental de la chromatine est la particule de noyau nucléosome qui contient ~ 147 pb d'ADN enroulé autour d'un complexe octamérique composé de deux copies de chacun des quatre histones (H3, H4, H2A, H2B). protéines histones abritent une pléthore de modifications post-traductionnelles (PTM). Ces substitutions covalentes induisent des altérations de la structure de la chromatine, directement en affectant la physico – chimie du système et , indirectement , en recrutant des activités de remodelage de la chromatine ^{1, 2, 3.} Par ces moyens, PTM histones contrôlent la chromatine accessibilité et, par conséquent, réguler toutes les fonctions cellulaires à base d' ADN ^4.

PTM sont installés par des systèmes enzymatiques histones modifiant principalement sur les segments N-terminaux non structurées (queues) de histo noyau nucléosome incorporénda. En raison des nombreux sites de modification sur la séquence relativement courte des queues d'histones, PTM influencent mutuellement en induisant ou en bloquant les réactions de modification ultérieure, un effet connu comme modification diaphonie ^5. En raison de l'architecture symétrique globale du nucléosome, des réactions de modification et les mécanismes de diaphonie ont été pensés pour produire de manière similaire sur les deux copies de chaque histone nucléosomale (histones soeurs). Ce concept a été récemment contesté et par la suite infirmée. En particulier, les dosages enzymatiques in vitro sur histones H3 libre queue peptides et sur nucléosomes ont démontré qu'un ensemble de kinases H3 introduit la phosphorylation de manière asymétrique ^6. En outre, l' analyse LC-MS / MS à base d'affinité , la purification a révélé l'existence de nucléosomes asymétriquement H3 méthylée dans plusieurs types de cellules eucaryotes ^7. Ainsi, nucléosomes asymétriquement modifiés constituent des espèces nouvelles, etoutils sont nécessaires pour découvrir les mécanismes qui contrôlent leur formation et d'analyser les effets de diaphonie que cette asymétrie pourrait exercer.

Communément, Western blot (WB) et la spectrométrie de masse (MS) analyse ont été utilisées pour détecter PTM histones. En dépit de son application facile, WB souffre de problèmes de spécificité / réactivité croisée. En plus de cela, il est incapable d'exécuter simultanément l' analyse multi-PTM et la quantification directe des réactions de modification ^8. D'autre part, l' analyse MS emploie une instrumentation sophistiquée qui nécessite une formation de haut niveau, mais fournit une haute spécificité ainsi que la cartographie simultanée et la quantification de plusieurs PTM ^9.   Cependant, les deux méthodes sont perturbateurs et les complexes sont dissociés nucléosomales avant l'analyse, ce qui donne naissance à un mélange d'histones et / ou des peptides dérivés de l'histone. Cette manipulation supprime la possibilité de faire la distinction indépendanteréactions de modification qui se produisent sur chacun des deux histones sœurs et à faire rapport de l'état de modification spécifique de copie des histones nucléosomales.

Résonance magnétique (RMN) nucléaire évolué comme une méthode alternative pour cartographier les réactions PTM. La RMN est non perturbatrice et permet ainsi le suivi des événements PTM d'une manière en temps réel dans des mélanges reconstitués, et même dans des cellules intactes ^{10, 11.} Le développement des routines pour l' acquisition rapide de données, ainsi que pour la cartographie à haute résolution sur la base 2D méthodes de corrélation hétéro-nucléaire d'échantillons marqués par des isotopes ⁽¹⁵ N et / ou ¹³ C) ¹² a permis l'application simultanée de différents types de PTM, par exemple comme la sérine / thréonine / phosphorylation de la tyrosine, la lysine acétylation / méthylation et l' arginine ¹³ méthylation. Selon le PTM sous enquête, ¹⁵ N- ou ¹³ C-étiquetage protocols peuvent être utilisés pour marquer le groupe fonctionnel de la protéine qui sert de rapporteur de modification. Par conséquent, la cartographie PTM peut être réalisée en suivant le déplacement de déplacement chimique caractéristique du groupe fonctionnel correspondant 'à détecter la modification de l'environnement chimique. Dans la plupart des cas, les deux groupes NH et chimiques CH peuvent être utilisés pour signaler l'évolution du PTM d'intérêt.

Le protocole actuel décrit la génération de nucléosomes contenant différentiellement histones sœurs marqués d'un isotope. Il combine la flexibilité de la spectroscopie RMN à la carte PTM utilisant à la fois ¹ H- ¹⁵ N et ¹ H- ¹³ C spectres de corrélation avec l'utilisation de protéines différentes étiquettes d'affinité pour la purification des complexes histone reconstitués sélectionnés. Notamment, le protocole utilise deux piscines différentes d'une histone particulière pour la reconstitution nucléosome. Ces piscines sont différentiellement marquée par un isotope (une avec <sup> 15 N, l'autre avec ¹³ C), et ils sont fondus à une polyhistidine et une étiquette d'affinité streptavidine, respectivement. Une affinité schéma de purification en tandem avec Ni-NTA et la chromatographie à base de streptavidine initialement utilisé par Voigt et al. ⁷ est utilisé pour purifier des espèces asymétrique de leurs homologues symétriques (figure 1A). Octamères d'histones asymétriques sont utilisées ultérieurement pour reconstituer des complexes nucléosomales équivalents (figure 1B), en utilisant la méthode de dialyse de sel norme ^14. En outre, grâce à la même procédure et en ayant l'une des piscines d'histones pré-modifié, un PTM peut être incorporé de manière asymétrique sur les nucléosomes résultant. La réaction de ces substrats avec des enzymes de modification d' histone et la cartographie subséquente résonance magnétique nucléaire des événements de modification permettent la caractérisation des mécanismes de diaphonie à la fois en cis (préalablement modifié la copie histone) et en trans (unmodified copie histone) (figure 1C).