Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples
Summary
Een werkwijze voor het stabiliseren en scheiden van natieve eiwitcomplexen van ongewijzigd weefsellysaat onder toepassing van een amino-reactieve eiwit-crosslinker gekoppeld aan een nieuw tweedimensionaal polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) systeem wordt gepresenteerd.
Abstract
Er zijn veel goed ontwikkelde methoden voor het zuiveren en bestuderen van enkele eiwitten en peptiden. Echter, de meeste cellulaire functies worden uitgevoerd door netwerken van interactie-eiwitcomplexen, die vaak moeilijk te onderzoeken zijn, omdat hun binding niet-covalent is en gemakkelijk verstoord wordt door zuiveringstechnieken. Dit werk beschrijft een werkwijze voor het stabiliseren en scheiden van natieve eiwitcomplexen van ongewijzigd weefsel door gebruik te maken van tweedimensionale polyacrylamide gelelektroforese. Weefsellysaat wordt geladen op een niet-denaturerende blue-native polyacrylamidegel, dan wordt een elektrische stroom aangebracht totdat het eiwit een korte afstand in de gel migreert. De gelstrook die het gemigreerde eiwit bevat, wordt dan uitgesneden en geïncubeerd met het amine-reactieve verknopingsreagensdithiobis (succinimidylpropionaat) dat eiwitcomplexen covalent stabiliseert. De gelstrook die verknoopte complexen bevat, wordt dan gegoten in een natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegel en tHij complexen zijn volledig gescheiden. De methode is gebaseerd op technieken en materialen bekend bij de meeste moleculaire biologen, wat betekent dat het is goedkoop en makkelijk te leren. Terwijl het is beperkt in haar vermogen om adequaat te scheiden extreem grote complexen, en is nog niet universeel succesvol geweest, de methode was in staat om een breed scala van goed bestudeerde complexen vast te leggen, en is waarschijnlijk van toepassing op veel systemen van belang.
Introduction
Normale cellulaire functie is afhankelijk eiwit-eiwitinteracties 1, 2. Daardoor worden menselijke ziekten vaak gekenmerkt door verstoringen in de assemblage en het gedrag van verschillende eiwitcomplexen 3. Het vermogen om dergelijke interacties te karakteriseren is daarom cruciaal. Gangbaar detecteren van deze interactie vereist zuivering van doeleiwitten, vaak gevolgd door pull-down hun interactie partners. Klassieke zuiveringstechniek wordt bereikt door differentiële centrifugatie, precipitatie en / of chromatografie 4. Deze werkwijzen zijn tijdrovend, moeten zij gedurende elk doelwiteiwit, vaak leiden tot lage opbrengsten. Moderne zuiveringsmethoden omvatten de fusie van peptidelabels om eiwitten te richten, gevolgd door immuunprecipitatie of extractie op kolommen beladen met kralen gebonden aan een vangmolecuul 5,"> 6. Hoewel dit rekbaar veel eiwitten, vereist sequentie modificatie van het doel, wat mogelijk tot constructies die verschillen in affiniteit voor hun gebruikelijke bindingspartners. De gevoelige aard van bepaalde eiwit-eiwit interacties betekent deze werkwijze niet van toepassing is te veel scenario's. Daarnaast is de pull-down assays gebruikt om in kaart eiwit-eiwit interacties kunnen geen nauwkeurige cellulaire beeld vast te leggen, als gevolg van beperkte mate van vrijheid en non-native niveaus van het aas eiwit.
Idealiter zou eiwitcomplexen worden gedetecteerd in hun eigen staten, zonder de noodzaak van zuivering of pull-down. Blauw natieve polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) werd ontwikkeld als een minder denaturerende alternatief natrium dodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) en maakt de scheiding van sommige eiwitten en complexen uit biologische monsters 7. Echter, eiwitten in BN-pagina's te scheiden op basis van een LARge aantal variabelen, zoals grootte, lading, driedimensionale structuur, en samen met andere moleculen. De interactie van deze factoren leiden vaak tot co-scheiding van eiwitten, aggregaatvorming en slechte eiwitband resolutie. Tweedimensionale native-polyacrylamidegelelektroforese lost sommige, maar niet alle, van deze problemen 8.
Om de complicaties van natief scheiding omzeilen sommige auteurs amine-reactieve verknopingsmiddelen, zoals dithiobis (succinimidylpropionaat) (DSP), om eiwitcomplexen te vangen in weefsellysaten 4. Deze behandelde lysaten kunnen vervolgens worden gedenatureerd en gescheiden door SDS-PAGE, met behoud van de oorspronkelijke afmeting en samenstelling van eiwitcomplexen. Aangezien verknoping reagentia reageren op basis van de nabijheid van één molecuul naar een ander, en eiwitten in weefsellysaten veel vrijheidsgraden en kan communiceren stochastisch niet-specifieke achtergrond kruis-linking kan hoog zijn, vooral in geconcentreerde monsters. Dit kan leiden tot moeilijk te interpreteren resultaten.
Hier tonen we het gebruik van een hybride BN-PAGE / SDS-PAGE-werkwijze, aangeduid als multimeer-polyacrylamidegelelektroforese (multimeer-PAGE), te scheiden en te detecteren eiwit samenstellingen in complexe mengsels. Aanvankelijk wordt cellysaat gesuspendeerd in polyacrylamidegel via BN-PAGE. Het lysaat bevattende gel wordt vervolgens met de verknopingsreagens DSP. Pseudo-geïmmobiliseerde en enigszins gescheiden op gel, eiwitten veel minder kans op niet-specifieke wijze reageren, waardoor achtergrond verknopingsmiddel reactiviteit wordt verminderd. Na verknoping wordt het gel banden uitgesneden en gescheiden via SDS-PAGE. De verkregen gel kan vervolgens worden geanalyseerd met alle middelen die gewoonlijk met polyacrylamidegelelektroforese. Deze werkwijze maakt de scheiding en detectie van eiwitcomplexen in ongemodificeerde weefsel lysaat zonder de noodzaak van extra zuivering of pull-down.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eiwit-eiwit interacties zijn belangrijk voor elke taak levende dingen uit te voeren. Vanwege dit, ze zijn het onderwerp van intensief onderzoek en onderzoek. Multimeer-PAGE is een nieuwe werkwijze voor het vastleggen, scheiden en analyseren van een breed scala van eiwitcomplexen. We hebben eerder aangetoond dat de toepasselijkheid ervan op het bestuderen van oligimerization van de ziekte-geassocieerde eiwit α-synucleïne 11. Het is echter uitbreidbaar vele eiwitcomplexen, zoals aangetoond in <st…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ondersteund door de NIH / NIDA DA034783. Wij danken Bryan A. Killinger voor technische bijstand met het multimeer-PAGE.
Materials
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
Riferimenti
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
- Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
- Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
- Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).
- Wong, S. S. . Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , (1991).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
- Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
- Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
