運動調節血清による靭帯構築物の治療：翻訳組織工学モデル

次の手順は、カリフォルニア大学デイビス校の制度審査委員会によって承認されたプロトコルに準拠しています。研究を始める前に地方倫理委員会に相談してください。 1.ヒトACLレムナントから一次線維芽細胞を単離する注：無菌性を維持し、生物学的安全キャビネット（BSC）のすべてのステップを実行します。 以下に説明するように、適切な倫理審査委員会からヒト組織の採取と使用に関する承認を得る。 100倍の抗生物質/抗真菌溶液を1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈して5x抗生物質/抗真菌（ABAM）溶液を調製する。 消化ステップまで4℃で保存し、50mLコニカルチューブで5倍ABAM溶液でACL組織断片を収集します。必要に応じて、1 x 1 x 1 cm 3の最大サイズまで、かみそり刃で組織をより小さな断片に切断します。 注意：地域のバイオハザード規則を遵守してください。バイオハザード物質の適切な使用とバイオハザード廃棄物の除染と処分。 組織断片を水に浸すのに十分な量のコラゲナーゼ溶液を調製する。 1×ペニシリン/ストレプトマイシンおよび20％ウシ胎仔血清（FBS）を含有する高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）にコラゲナーゼII型（1mg / mL）を溶解し、0.22μmでフィルターする。 ACL組織をPBSで3回すすぐ。 組織を消化する。 ACL組織を新しい50mLコニカルチューブに移し、十分な量のコラゲナーゼ溶液を加えて組織を沈めます。 37℃で一晩（〜17時間）インキュベートする。 消化期間が完了する前に、10％FBSおよび100U / mLペニシリンを含むDMEM高グルコース培地を補充することによって増殖培地（GM）を調製する。 消化時間が完了する15分前に、組織含有50mLチューブを5分間に3回短時間ボルテックスする。 25 mLの血清学的ピペットを使用して、消化した組織を激しく粉砕してtiを破壊する細胞をさらに押し上げる。 1,500 xgで5分間遠心する。上清を吸引し、10mLのGMでペレットを再懸濁する。 手順1.8-1.9をさらに3回繰り返します。 最後の遠心分離の後、ペレットを5-10mLのGMに再懸濁する。細胞懸濁液の小さなサンプルを使用して、血球計数器で細胞数を測定し、トリパンブルーを用いて細胞生存率を評価する。 細胞懸濁液を15cm組織培養プレート上に3〜4×10 5細胞/プレートの密度でプレートする。 37℃および5％CO 2で維持された滅菌インキュベーター中で70％コンフルエンスまで培養し、GMを3日ごとに交換する。 5継代以内に細胞を使用または保存する（以下を参照）。 将来の使用のために細胞を凍らせる。 次のように70％コンフルエンスで細胞をトリプシン処理する。培地を吸引し、PBSで細胞を洗浄する。組織培養プレートの底を覆うだけの十分な予熱（37℃）の0.05％トリプシンを加える。プレートを培養インキュベーションに置く細胞が剥がれるまで（細胞が光学顕微鏡を使用して浮遊していることを確認する）~5分間アトルアする。ピペットを用いて細胞を集め、ファルコンチューブに分注する。 遠心分離して細胞をペレット化し、20％FBSおよび10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含むDMEM高グルコース培地に細胞を再懸濁する。細胞懸濁液をクライオバイアルに分注し、少なくとも24時間-1℃/分で冷却する。冷凍冷凍液を液体窒素中で保存する。 2.シリコーンでコーティングされたプレートの準備 35 mm組織培養プレートを準備する：蓋を取り外し、平らな面に開いたプレートを配置する。 製造元の指示に従ってシリコーンエラストマーキットを混合する。 35 mLプレートあたり約2 mLを分注するために10 mLシリンジを使用します。 室温で2〜3日間シリコーンを硬化させます。 3.ブラッシュセメントアンカーの準備 予め、円筒状のものを含むシリコーン逆型を準備するアンカー形成のためのlls。逆型は、所望のアンカーの形状およびサイズの仕様にすることができる。 最終的なアンカーの所望の高さと直径を決定する。このプロトコールは、直径約3.25mmのプラスチックシリンダーが置かれた35mmの組織培養皿に工作用シリコーンから形成されたカスタムメイドのモールドを使用し、約6.5mmの最終モールド高さを可能にする。最終的なアンカーの寸法は、高さが約3~3.5mmで、直径が約3.4mmであり、アンカーの底部から1.5mmのピンが突出している。 モールドが作られる35mmの皿に未硬化のシリコーンを加える。それに応じてプラスチックシリンダーを置きます。 注：プラスチック製のシリンダーのサイズは、最終アンカーの直径を決定します。プラスチックシリンダーの配置および使用されるシリコーンの量は、異なる高さのアンカーを生成するように変更することができる。型内のウェルの底部と型自体の底部との間の厚さは、dどのくらいのピンがアンカーの底から突き出て、アンカーが後でシリコーンコーティングされた皿にしっかりと固定されることができるかを決定する。 シリコーンを硬化させた後、プラスチックシリンダーを取り出し、金型を35mmディッシュから取り出します。 3.5Mオルトリン酸/ 100mMクエン酸溶液を調製する。 0.961gのクエン酸を11.5mLのオルトリン酸に溶解する。 MilliQ水で溶液の容量を50 mLにする。室温で溶液を保存し、光から保護する。 金型を準備する：金型内の各円柱の中心に1つの金型ピンを置きます。 氷上でプラスチック製の秤量ボートにβ-リン酸三カルシウムとオルトリン酸/クエン酸溶液を1g / mLの濃度で混合する。 プラスチックセルスクレーパーを用いてセメントを激しく混合する。 セメントを粉砕して混合を継続し、混合物を型内にピペットで入れる。 充填した型を2,250 x gで1分間遠心分離する。 ブルサライトセメントアンカーを室温で一晩放置する。 金型からアンカーを取り外し、各シリコーンコーティングされたプレートで2つのアンカーを12 mm離して固定します。 70％エタノールを噴霧して固定プレートを滅菌し、プレートと蓋の両方を満たし、BSCに入れる。少なくとも30分後、プレートを吸引し、蓋を交換し、必要になるまでBSCに保存する。 4.ヒト血清を取得する適切な倫理審査委員会の承認がこのプロトコルについて得られたことを確認する。 ヒトの被験者から、血清中の所望の変化をもたらす所与の介入（ 例えば 、運動、食物または薬物介入）に参加する書面によるインフォームドコンセントが得られていることを確認する。ここでは、安静時と抵抗運動後15分のコレクションについて説明します。 訓練された静脈瘤師を用いて、静脈穿刺によって適切な退院した容器に、被験者からの安静時血液サンプルを得る。 </li> 参加者が所望の運動計画に従事した15分後に運動後の血液サンプルを採取する。先に記載したように、この実験における抵抗運動プロトコールを使用して、内因性生化学応答を刺激する。 参加者にセット間で1分間の休憩を取って5組のレッグプレスを実行させる。次に、参加者に休息なしで連続して膝伸展セットとハムストリングカールセットを行い、セット間で1分間の休憩で3回連続してエクササイズを繰り返します。 血液を凝固させてから1,500 xgで10分間遠心する。滅菌条件下で、将来の培地補充（4℃で保存した血清）および生化学的分析（-20℃で保存した少量の血清）で滅菌試験管に血清を移す。 5.フォーム加工された靭帯注：事前に、一次ファイルを展開するピンブラシントアンカーを用いてシリコーン被覆プレートを調製する。 試薬を準備する： トロンビンを調製する。ウシトロンビンを200U / mLでDMEM高グルコース培地に溶解する。 0.22μmでろ過し、-20℃で保存します。 フィブリノーゲンを調製する。ウシフィブリノーゲンをDMEM高グルコース培地に20mg / mLで溶解する。 37℃の水浴中で3〜4時間インキュベートし、溶解を助けるために30分ごとに旋回させる。 0.22μmでろ過し（複数のフィルターが必要な場合があります）、分注し、-20℃で保存します。 アプロチニンを調製する。アプロチニンを水中に10mg / mLで溶解する。 0.22μmでろ過し、-20℃で保存します。 アミノヘキサン酸を調製する。アミノヘキサン酸を水に0.1g / mLで溶解する。 0.22μmでろ過し、4℃で保存します。 アスコルビン酸を調製する。アスコルビン酸をDMEM高グルコース培地に50mMの濃度で溶解する。 0.22μmでろ過し、4℃で保存する。 <L-プロリンを調製する。 L-プロリンを50mMの濃度でPBSに溶解する。 0.22μmでろ過し、4℃で保存する。 形質転換成長因子-β1（TGF-β1）を調製する。 TGF-β1を10μg/ mLの濃度で製造元の指示に従って再構成する。等分し、-20℃で保存する。 実験に必要な構築物の数を決定し、十分な数の固定プレートが準備されていることを確認する。生物学的複製および技術的複製の両方が推奨される。ここで強調された研究1では、重複した技術的複製物および12の生物学的複製物（安静時および運動後の12人の血清からの血清）を使用する。 注：BSCの無菌条件下で以下の手順を実行します。 15cmプレートで70％コンフルエントになるまで培養することにより細胞を拡大する。 2.5×10 5個の細胞が構築物ごとに必要とされる。 細胞をトリプシン処理し、3.67×10の濃度でGM中に再懸濁する5細胞/ mL。 必要な構築物の数のマスターミックスを生成する：1構築物について、マスターミックスは、681μLの細胞懸濁液（2.5×10 5細胞を含む）、29μLのトロンビン、2μLのアプロチニンおよび2μLのアミノヘキサン酸を含有する。 マスターミックスをよく混合した後、各ピン止めプレートに714μLを「図8」のパターンで添加する。マスターミックスがアンカーの側面に直接接触するようにしてください。 マスタープレートをプレート全体に均等に分配するために、各プレートを静かにタップします。 一度に1枚のプレートにつき、素早く1枚のプレート上に均一に滴下して286μLのフィブリノーゲンを添加し、プレートをBSCの表面上で前後にスライドさせてフィブリノゲンを分布させて細胞包埋フィブリンゲルを形成させる。次のプレートに進みます。 37℃および5％CO 2で維持された滅菌インキュベーターに構築物を置き、インキュベートする少なくとも15分間、フィブリノーゲンの重合を可能にする。 1構築物につき2mLのために十分な供給培地（FM）を調製する。 GMに200μMのアスコルビン酸、50μMのプロリン、および5ng / mLのTGF-β1を補充する。 各構築物をカバーするために2mLのFMを加える。 37℃および5％CO 2で維持された滅菌インキュベーター中で構築物を全部で14日間または所望の終点まで培養し、毎秒2mLのFMで培地を清澄化する 6.引張試験による人工靭帯注：引張り試験は、PBS浴中のカスタムビルドテンションテスターを使用して実施した。力変換器に連結された逆成形グリップは、試験中にブルサイトセメントアンカーを適所に保持する。 デジタルキャリパーを使用して靭帯構成物の長さおよび幅を決定する;組織の断面積を計算する。 プレートから靭帯構成物を解き放し、アンカーを構造体がPBSに沈められていることを確認してください。 グリップ間の距離を調整し、構造の長さを初期長さに設定します。 試験を開始する：0.4 mm / s（または〜3％/ s）の歪み速度で構造物を破損までひずませる。 試験が完了したら、コラーゲン含有量のために組織残留物を処理する（セクション7参照）。 得られた荷重 – 変形データから、応力 – 歪みデータを計算し、関心のある機械的特性を定量化する。 （ すなわち 、応力 – 歪み曲線の線形領域にわたる弾性特性）のような、最大の引張り荷重、最大引張り強さおよび弾性率を有する。 7.操作された靭帯のコラーゲン含量の定量ブルータイトセメントアンカーから人工靭帯を取り外し、120℃で25分間乾燥させる。 コンストラクトの乾燥質量を決定し、個々の1.5mLチューブに入れる。乾燥構築物は、室温さらなる処理まで。 各構築物に、200μLの6M HClを添加する。ヒュームフードで2時間加熱ブロック内で120℃で煮沸する。 注意：HClは非常に腐食性があり酸性ですので、沸騰防止/安全ロックチューブの使用やその他のチューブの固定方法を推奨します。 チューブを短時間遠心して液体を集め、ヒュームフード内で1.5時間加熱ブロック内で120℃で蒸発させるためにキャップを外したままにします。 得られたペレットを200μLのヒドロキシプロリン緩衝液に再懸濁する。必要になるまで-20℃で保管してください。 ヒドロキシプロリン緩衝液を調製する。 300mLの水に、16.6gのクエン酸、4mLの酢酸、11.4gのNaOHを加え、溶解するまで撹拌する。 pHを6-6.5に調整し、容量を500mLにする。 250μLのトルエンを防腐剤として添加し、光から保護された4℃で保存する。 試薬を準備する。 トランス-4-ヒドロキシ-L-プロリンを調製する。水に溶解して4 mg / mL溶液にする。 <クロラミン-Tを調製する。水に溶解して14.1 mg / mLの溶液にする。 アルデヒド – 過塩素酸塩を調製する。 1.5 mLの4-ジメチルアミノベンズアルデヒドを6 mLの1-プロパノール、2.6 mLの過塩素酸（注意：腐食性の強い酸化剤、適切な注意を払う）および0.5 mLの水に溶解する。 新しい1.5mLチューブセットで、各再懸濁ペレットのサンプルをヒドロキシプロリンバッファーで200μLの容量に希釈します。 注：希釈液は、試料の予想されるコラーゲン含量に応じて、試料：緩衝液の1：4〜1：50の範囲であり得る;したがって、所与のサンプルセットに適切な希釈係数を決定するために（すなわち、サンプルを標準曲線の中央に向けて）配置するために、いくつかの試行錯誤試験が必要とされ得る。 ヒドロキシプロリン標準液を調製する。ヒドロキシプロリン緩衝液（セクション7.5.1参照）を80μg/ mLに希釈する。連続希釈を行い、0〜20μg/ mLの間で6〜8 200μLの標準液を作成します。 150μLの14.1mg /mLのクロラミンT溶液を各標準試料および希釈試料に添加する。ボルテックスし、室温で20分間インキュベートする。 150μLのアルデヒド – 過塩素酸塩溶液を各サンプルおよび希釈サンプルに添加する。ボルテックスし、60℃の加熱ブロックで15分間インキュベートする。過剰のアルデヒド過塩素酸塩溶液は、地方条例（過塩素酸を含む）に従って有害廃棄物として処分してください。 標準品とサンプルを冷ましてから、それぞれ200μLずつを96穴プレートに2重に分注します。 分光光度計でプレートを550 nmで読み取る。地方条例（過塩素酸含有）に従って、プレートおよび残りの容積を危険廃棄物として1.5 mLチューブに処分する。 総コラーゲンおよびコラーゲン画分の計算。 ヒドロキシプロリン標準曲線を使用して、各サンプルの吸光度値をマイクロプログラムのヒドロキシプロリンに変換する。 各ウェルに2.5を乗じて、ヒドロキシプロリンの量を計算する。希釈サンプル。各サンプルウェルに500μLの全混合物200μL（200μL希釈サンプル+150μLクロラミンT +150μLAP溶液）を添加することを思い出してください。 元のサンプル中のヒドロキシプロリンの量を計算するために希釈係数（第7.7節）を掛けます。 コラーゲンの量を計算するために0.137で割る（コラーゲンが13.7％のヒドロキシプロリン20を含むと仮定する）。 注：哺乳動物のヒドロキシプロリンのコラーゲン存在量は、組織や哺乳類の種によって若干異なります。例えば、ブタおよびヒツジアキレス腱は、それぞれ13.5および13.7％（ヒドロキシプロリン質量/乾燥組織質量）を含有する21 。ここでは、コラーゲン中のヒドロキシプロリンのパーセントを推定するために13.7％を使用し、これを用いて次の式を用いて組織サンプルのコラーゲン含量を計算する： 乾燥質量で割ってコラーゲンフラを計算するパーセンテージに変換します。 8.分子エンドポイントの定量注：引っ張り試験とコラーゲン含量の主要結果に加えて、分子エンドポイントを2Dまたは3D組織で測定し、機械的な洞察を加えることができます。バイオアッセイを用いて、分子エンドポイントを決定することができる（ インビトロでの靭帯機能に対する運動後の血清環境の影響に関する文脈については、以下のセクションを参照のこと）。 3D組織の場合： 上記の手順5に従って構築物を準備する。 処置/介入を構築した後、液体窒素中で構築物をスナップフリーズする。 ドライアイスで冷却した乳鉢と乳棒を使用して、コンストラクトを粉末に粉砕する。ステップ8.4 / 5に続きます）。 2D組織の場合： 培養ヒトACL線維芽細胞を集密するDMEMを含有する6ウェルプレート中で培養した。 DMEMを吸引し、あなたの実験戦略（ 例えば 、時間経過または用量応答実験）に従って処置培地を適用する。 処理培地を吸引し、細胞をPBSで洗浄する。 適切な抽出バッファー/試薬（次を参照）を使用して収集する細胞をこすります。 タンパク質発現解析：タンパク質溶解物を得るために、細胞質ゾル抽出バッファー（ 例えば 、250mMスクロース、50mM Tris pH7.4,5mM MgCl 2、およびプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤カクテル）を用いる。タンパク質濃度アッセイを実施し、標準的なウェスタンブロット法に従って分析を続ける。 遺伝子発現解析：高品質のRNAを得るためにメーカーの指示に従って500μLのRNA単離試薬を用いて全RNAを単離します。標準的な手順に従って、逆転写およびリアルタイム定量PCR分析を行います。 DNA単離：gを単離して定量するDNA単離試薬を用いてエノムDNAを製造元の説明書に従って使用して精製した。分光光度計を使用してDNA濃度を定量し、260 nmでのサンプル吸光度を測定する。