액체 크로마토그래피 이온 이동성 QTOF 질량 분석에 의해 단백질 바이오에 주인 세포 단백질의 정량화에 대 한 HS MRM 분석 결과

1. infliximab 다이제스트 (~ 24 h 절차)의 준비 50mm 염화 중 탄산염, 1% 음이온 계면 활성 제 50mm NH4HCO3, 500 m m dithiothreitol (DTT) 50mm NH4HCO3, 및 50 mM NH4HCO3500 m m iodoacetamide (IAM)의 신선한 솔루션을 준비 합니다. 50mm NH4HCO3의 750 µ L에 infliximab mAb (10mg/mL)의 200 µ L와 1%의 음이온 계면 활성 제 용액의 50 µ L을 추가 하 고 0.05% 음이온 계면 활성 제 존재 60 ° C에서 15 분 동안 단백질을 변성. 500 mM DTT의 40 µ L을 추가 하 고 20mm DTT의 면 전에 서 60 ° C에서 60 분에 대 한 샘플을 줄일. 500 mM IAM의 20 µ L을 추가 하 고 ~ 10 mM IAM의 어둠 속에서 실 온에서 30 분에 대 한 샘플을 알. MS 시퀀싱 급 리스 C/trypsin의 20 µ g를 포함 하는 유리 유리병에 microcentrifuge 튜브의 내용을 추가 하 고 37 ° c.에 3 h에 대 한 샘플을 소화 MS 시퀀싱 급 리스 C/트립 신 다이제스트 샘플 하룻밤 (12-15 h) 37 ° c.에서의 20 µ g를 포함 하는 다른 유리 유리병을 소화 샘플을 전송 하 여 두 번째 효소 aliquot (20 µ g)를 추가 하룻밤 베이스 후 100% 포 름 산 (FA)의 5 µ L을 추가 하 고 산 성 정한 음이온 계면 활성 제를 분해를 37 ° C에서 30 분에 대 한 다이제스트를 품 어. 음이온 계면 활성 제의 불용 성 구성 요소 침전을 원심 분리기에 4000 x g에서 15 분에 대 한 다이제스트 아래로 회전 합니다. ~ 1000 µ L infliximab 다이제스트의 복구를 액정 자동 샘플러 유리병; 다이제스트 농도 ~ 2 mg/mL 해야 합니다. LC/MS 시스템 분석에 대 한 준비가 될 때까지는-20 ° C에서 냉동 실에 다이제스트를 저장 합니다. 2. 급상승 펩타이드 표준 (~ 30 분) 실 온에서 벤치에 유리 유리병에 냉동된 샘플을 배치 하 여 infliximab 다이제스트를 녹여. 유리병 (유리병 각 펩 티 드의 1 nmol 포함)에 포함 된 FA H 한 토끼 phosphorylase b (포)2O 다이제스트 유리병에 1 µ M 포 라고에서 모든 6 개의 펩 티 드 표준에 대 한 재고 솔루션을 준비 하는 0.1%의 1 mL를 추가 합니다. 0.1, 1, 10, 및 100 nM 펩 티 드, 0.1%를 사용 하 여 포함 하는 솔루션을 얻기 위해 포 재고 솔루션의 4 x 1 mL 희석 준비 희석 용 매로 FA. 유리 튜브 (LC 자동 샘플러 튜브)에 모든 희석을 준비 하 고 모든 튜브에 배경 매트릭스로 infliximab 다이제스트의 100 µ L를 추가 합니다. 각 10 µ L 주입으로 열에 다이제스트 배경 2 µ g를 로드 합니다. 희석된 infliximab 다이제스트를 포함 하는 빈 샘플 준비 (동일한 1시 10분 희석), 아무 아군된 펩 티 드와 함께. 3. LC/HDMS 전자 데이터 수집 방법의 설정 주: HS MRM 인수를 설정 하는 데 필요한 단계를 요약 하는 워크플로 그림 1에 묘사 되 고 섹션 3-6에 자세히 설명 되어. 데이터 독립적인 HDMS전자 데이터 집합의 수집 각 모니터링된 펩 티 드, 분무 이온화, 다음 가장 풍부한 펩 티 드 이온의 부모 m/z의 보존 기간을 설정 하는 데 필요한 및 해당 CCS (collisional 크로스 섹션) 이온 이동성 분리에서 파생. 또한, 데이터 독립적인 집합 각 펩 티 드 선구자에 대 한 3 개의 가장 풍부한 조각 이온의 m/z에 관한 정보를 제공합니다. 워크플로 (CE 최적화)의 두 번째 단계에서는 분석 결과의 감도 조정 각 조각 이온에 대 한 높은 이온 강도를 충돌 세포 에너지 증가 됩니다. 마지막으로, 마지막 단계에서 위에서 설명한 모든 매개 변수 모니터링 각 펩 티 드에 대 한 HS MRM 기가에 소개. 4 중 극 비행 시간 (QTOF) 질량 분석기 (HDMSE) 독립적인 데이터 수집 방법을 사용 하 여 울트라 고성능 액체 크로마토그래피 시스템에 결합에 LC/MS 실험을 수행 합니다.참고: 악기 구성에 관한 자세한 내용은 소재 섹션에 포함 됩니다. 이 악기는 펩 티 드 선구자10의 분리에 대 한 여행 파 이온 이동성 장치를 사용합니다. 0.1% 물 (용 매 A)에서 FA와 0.1%를 포함 하는 두 모바일 단계 준비 이기 (용 매 B)에서 FA.참고: 아군된 mAb 다이제스트의 분리에 대 한 청구 표면 하이브리드 (CSH) C18 열 (2.1 x 150 m m, 1.7 µ m 입자와 포장)를 사용 합니다. 데이터 수집 소프트웨어에서 “만들기/분석 방법”에 클릭 하 고 선택 “인수를 생성 하 고 처리 하는 방법.” 메서드 이름을 입력, 방법 폴더 (디렉토리)를 탐색 하 고 “다음”을 클릭 “분석 유형”에 대 한 “펩 티 드 지도 (IMS),”를 선택 하 고 “악기 시스템” 탭에서 “제 사기 용 매 관리자” 악기를 선택 합니다. 200 µ L/분 사용 용 매 B 30 분에서 뒤에 2 분 열 세척과 9 분 평형 40 %1에서 그라데이션 차입의 유량에서 펩 티 드 분리를 달성, 50 분의 총 런타임은 이러한 실험 소개 그라데이션 설정 편집 LC 메서드 편집기에서 매개 변수입니다. “악기 시스템” 탭에서 “샘플 관리자” 악기를 선택 합니다. 샘플 온도 10 ° C와 60 ° c 열 온도를 설정합니다 긍정적인 이온 30000 FWHM의 전형적인 해결 능력으로 ESI 감도 모드에서에서 QTOF 질량 분석기를 작동 합니다.참고: 낮은 에너지 (MS 채널 1 스캔에 대 한 6 V)와 높은 에너지 (15-40 V 경사로 사이 LC/HDMSE 는 빠르게 검사 (충돌 셀)에 충돌 에너지를 교류를 수집 하 여 운영 하는 독립적인 데이터 수집 (디 아) 모드 MS 채널 2에서에서 전조 선택 없이 조각화 스펙트럼 생성). 데이터 수집 소프트웨어에 기본 소스 관련 MS 매개 변수를 입력: “내 작품/악기 시스템,”에서 “Vion IMS Qtof” 탭을 선택 하 고 “도구” 메뉴에서 이러한 매개 변수를 입력: 3.0 k v 모 세관 전압, 100 ° C 소스 온도, 100 V 소스 오프셋, 50 L/h 콘 가스 흐름, 그리고 40 V 콘 전압. Desolvation 온도 250 ° C, 500 L/h, desolvation 가스 유량 및 설정 3.0 기준 모 세관 전압 kV. 데이터 수집 소프트웨어에서 “만들기/분석 방법”에 클릭 하 고 선택 “인수를 생성 하 고 처리 하는 방법.” 메서드 이름을 입력 하 고 메서드 폴더 (디렉토리)를 이동한 다음 클릭 합니다 “다음.” “분석 유형”에 대 한 “펩 티 드 지도 (IMS),”를 선택 하 고 “악기 시스템” 탭에서 “Vion IMS QTof” 악기를 선택 합니다. 마침 클릭 합니다 “.”참고: 새로 만든된 LC/HDMSE 방법 “악기 방법 구성” 화면에서 자동으로 열립니다. “설정” 탭에서 이러한 매개 변수를 입력: 3.0 k v 모 세관 전압, 소스 온도 100 ° C, 250 ° C desolvation 온도, 50 L/h 콘 가스 흐름, 그리고 500 L/h desolvation 가스 흐름. “실험” 탭 설정에서 “높은 정의 MSE”를 선택 하 고 선택 “분석 방법은 런타임입니다.” “검색 설정” 탭에서 이러한 매개 변수를 입력: 낮은 질량, 100; 높은 질량, 2000; 그리고 검색 시간, “CE” 탭에서 400 양 낮은 에너지 설정에 대 한 “6 V”를 입력 하 고 “사용 안 함 데이터 감소” 체크를 확실히 확인 대 40 15에서 에너지 램프를 선택. 50 ng/mL, 신 enkephalin (르) 0.1%와 50% 이기에 준비의 솔루션에 주입 잠금 질량 캘리브레이션 데이터 수집 중에 10 µ L/min의 유량에서 FA.참고: 잠금-대량 데이터 같은 대량 범위 같은 획득 율을 사용 하 여 모든 5 분 획득 됩니다. (열에 로드 하는 금액은 각 펩 티 드 표준에 대 한 100 fmol) 샘플의 10 µ L를 주입 하 여 위에서 설명한 LC/HDMSE 분석 결과 사용 하 여 10 nM, 포 아군 샘플을 분석 합니다. 4. 충돌 에너지 (CE) 최적화를 위한 Tof MRM 방법의 설정 LC/HDMS전자 데이터 집합에서 보존 기간, 선구자, 및 각 포 펩 티 드에 대 한 조각 이온 m/z를 얻을. M/z와 가장 풍부한 대 한 충전 상태를 유지 선구자 이온 및 가장 풍부한 해당 3 조각 이온.참고: 일반적으로 LC/HDMSE 분석 결과 의해 기록 된 낮은 에너지 및 에너지 스펙트럼의 예는 그림 2에 표시 됩니다. SRM/MRM 실험에서 충돌 에너지 (CE) 최적화를 사용 하 여 각 펩 티 드23에 대 한 최고의 신호를 얻으려면. 데이터 수집 소프트웨어에서 “만들기/분석 방법”에 클릭 하 고 선택 “인수를 생성 하 고 처리 하는 방법.” 메서드 이름을 입력, 방법 폴더 (디렉토리)를 탐색 하 고 “다음”을 클릭 “분석 유형,” 선택 “계량” “계량 분석 결과 크로마 Tof 2D”를 선택 하 고 클릭 합니다 “.” “악기 시스템” 탭에서 “Vion IMS QTof”를 선택 하 고 마침 클릭 합니다 “.”참고: 새로 만든된 Tof MRM 메서드는 “악기 방법 구성” 화면에서 자동으로 열립니다. “설정” 탭에서 이러한 매개 변수를 입력: 3.0 k v 모 세관 전압, 소스 온도 100 ° C, 250 ° C desolvation 온도, 50 L/h 콘 가스 흐름, 그리고 500 L/h desolvation 가스 흐름. “실험” 탭 설정에서 “함수 테이블”을 선택 하 고 선택 “하나 이상의 MS, MSM 또는 MRM 기능.” 아래쪽 화살표를 사용 하 여, 3 “전환” (가장 풍부한 전조와 그것의 가장 풍부한 조각 이온의 3의 조합)를 입력 하 여 각 펩 티 드에 대 한 “Tof-MRM” 기능을 설정 합니다.참고: Tof MRM 모드에서 높은 감도 달성 예정 된 MRM 접근을 사용 하 여. “Tof-MRM” 함수 편집기에서 선택 각 펩 티 드 (적어도 1 분 긴), 대 한 보존 시간 창 펩 티 드 차입 순서에 따라 정렬 합니다. “Tof-MRM” 함수 편집기에서 삽입 펩 티 드 선구자 m/z와 제품 m/z; 펩 티 드 선구자;에 대 한 “낮은” (창 4 다) 쿼드 격리 창 선택 100 밀리초; 고정된 검색 시간을 선택 14-36 V의 범위에서 12 개의 다른 충돌 에너지 값을 다음과 같이 선택 하 고: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 그리고 36, 그림 3에서 예제 에서처럼.참고: 위에서 설명한 Tof MRM 방법으로 크로마 피크 당 적어도 10 데이터 포인트 각 전환에 지정 된 각 CE에 대해 수집 됩니다. 데이터 파일 크기를 줄이려면 조각 이온의 신호 (창 6-다) “넓은” 옵션을 선택 합니다. CE 최적화 값의 예는 표 2에 표시 됩니다. (열에 로드 하는 금액은 각 펩 티 드 표준에 대 한 100 fmol) 샘플의 10 µ L를 주입 하 여 위에서 설명한 Tof MRM 분석 결과 사용 하 여 10 nM, 포 아군 샘플을 분석 합니다. 5. 펩 티 드 선구자의 이온 이동성 분리를 사용 하 여 펩 티 드 정량화에 대 한 최종 HS MRM 수집 방법의 설정 데이터 수집 소프트웨어의 “조사” 메뉴에서 모든 펩 티 드에 대 한 각 CE에 대해 생성 된 모든 11 크로마 흔적을 표시 하 고 봉우리는 “처리 옵션/작업” 도구 모음;에서 “통합” 버튼을 사용 하 여 통합 높은 피크 지역 각 전환에 대 한 최고의 CE 표시 됩니다. 시각적으로 각 펩 티 드의 3 조각에 대 한 최고의 피크 넓이 비교 하 고 유지만 최고 “전환” (조각 이온 가장 강한 신호를 생성 하는); 표 2는 최고 4 개의 포 펩 티 드에서 얻은 “전환”이 표시 됩니다. 펩 티 드 당 하나의 조각 이온을 포함 하는 HS MRM 메서드를 설치. LC/HDMS전자 데이터 집합에서 각 펩 티 드 선구자의 CCS 값을 사용 합니다. “Tof-MRM” 기능 대신 “HS-MRM” 기능을 선택 하 여 이전 섹션 (제 4)에서 만든 Tof MRM 메서드를 수정 합니다. “HS-MRM” 함수 편집기에서 다음과 같은 전조 관련 매개 변수를 입력: m/z, 4 중 극 해상도: 낮은 (4 다), 충전 상태, 전조 CCS 값 및 전조 CCS 해상도: 낮은. 제품 이온의 m/z, 최적의 충돌 에너지 입력, 0.4 s와 선택의 검색 시간을 선택 “” 광범위 한 설정 (6 다) 그것의 동위의 모든 포함 하도록. 모든 4 개의 펩 티 드에 대 한 최종 HS MRM 수집 방법의 예는 그림 4에 표시 됩니다. 모든 샘플 mAb 다이제스트 빈 시작 HS MRM 방법을 사용 하 여 (비 아군 샘플), 뒤에 다음과 같은 농도의 4 복제 주사 (10 µ L 각) 분석: 0.1, 1, 10, 및 100 nM 포 펩 티 드. 6. 창조의 HS MRM 데이터 집합의 분석에 대 한 처리 방법 HS-MRM 데이터 집합의 분석에 대 한 처리 메서드를 만듭니다. 분석 방법 “HS-MRM” 데이터 수집 방법에 대 한 생성, “목적” 탭을 클릭 하 고 선택 “관리 구성 요소.” “실험 유형” 드롭다운 메뉴에서 “HS MS/MS/HS-MRM” 옵션을 선택 합니다. “만들기/새 항목”을 클릭 하 고 처리 메서드 편집기에서 다음 매개 변수를 소개: 펩 티 드 보존 시간 (RT), 전조 충전 상태, 전조 m/z, 그리고 전조 드리프트 시간 (DT). 조각 이온에 대 한 m/z 및 충전 상태를 입력 하 고 “XIC” 추적 추출 모드를 지정 합니다. 같은 “HS-MRM” 수집 방법의 “목적” 탭에서 “기본 금액”에 클릭 하 고 다음 농도 입력: 0.1, 1, 10, 및 100 nM 포 펩 티 드. “처리/추출 설정”에서 다음 매개 변수를 입력: 기본 대량 관용, 10 ppm (모든 조각 이온의 m/z)에 대 한 기본 시간, 5%; 드리프트 포 펩타이드 처리 방법의 예는 그림 5에 표시 됩니다. 교정 유형에 대 한 선형 커브 피팅 1 /2 가중치 X를 선택 합니다. 모든 chromatograms를 통합 하 고 각 포 펩 티 드의 보정 곡선을 건설 하기 위하여 HS MRM 데이터를 처리 합니다.