Solea Senegalensis 정 충에 반응성 산소 종의 세포내 위치 평가
Summary
이 프로토콜 H2O2 지역화 Solea senegalensis 정 충을 사용 하 여 민감한 형광 색소 DCFH 다 선생님, 미토 콘 드리 아에 대 한 라이브 미토 콘 드리 아 얼룩 DAPI 핵에 대 한 내 검색에 대 한 자세한 방법을 설명 합니다. 시각화, 각각. 프로토콜은 신선한 또는 해 동 정 충으로 2 시간 내에서 수행 하도록 설계 되었습니다.
Abstract
산화 스트레스는 감소 하는 정자의 품질에 중요 한 요소 중 하나입니다. 어떤 종에서 높은 중요성의 이다 정 충에 반응성 산소 종 (선생님)을 탐지 하기 위한 효율적인 프로토콜을 개발 하지만 이러한 메서드는 거의 사용 하 고 덜 teleost에. Cryopreservation은 유전자 은행을 포함 하 여 다른 목적에 대 한 양식 업에 유용한 기술 이며 연중 정자 가용성을 보장 합니다. 냉동/해 동 절차 선생님 생산을 일으킬 수 있고, 정자 세포 손상. 고려는 예비 손상 선생님 생산의 과잉 발생할 수 그들의 지역화, 여기에 따라 정 충에 H2O2 를 감지 하 고 그것의 세포내 지역화 confocal 현미경 검사 법에 의해 평가 하는 상세한 방법론 제공 됩니다. 이 위해 3 형광 (2, 7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-다), 라이브 미토 콘 드리 아 얼룩 및 4, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI))의 조합2 H2O의 공동 지역화를 평가 하 되 정 충 핵 이나 미토 콘 드리 아 Solea senegalesis 정자 샘플에.
Introduction
정자 품질 반응성 산소 종 생산 연결 되었습니다 최근1. 미토 콘 드리 아에서 선생님 생산 정상적인 생리 적인 과정 이라고 여겨질 수 있다, 비록 선생님 생산의 과잉에 의해 산화 스트레스 서로 다른 수준에서 정 충에 손상의 명확한 원인입니다. 인간에서는, 산화 스트레스는 남성 불 임, 운동 성 및 capacitation2;을 능력 변경 관련 포유류에서 냉동된 정자 샘플에서 DNA 무결성의 변화는 H2O23의 합성에도 관련 되어있다.
Cryopreservation은 유전자 은행 양식 업에 대 한 일반적인 기법입니다. 이 기술은 Solea senegalensis같은 생식 문제 종에서 특히 중요 하다. 시장에서이 귀중 한 종 구 혼의 부족으로 인해 포로에서 태어난 개인 생식 기능 장애를 보여줍니다. 이 사실은 정자 cryopreservation 인공 수정 위한 정자 가용성 필요 합니다. 그러나, cryopreservation 연구 항 산화 보충의 유익한 효과 보고 있다 정 충4 해로운 수 있는 산화 스트레스의 원천이 될 수 있습니다. 선생님 억제 대상으로 미토 콘 드 리아 산화를 통해 소문에 하면 정자 cryopreservation 노란색 메기5에 대 한 유익한 했다.
따라서, 정자 샘플에서 선생님의 수준을 알고, 특히 cryopreservation6,7 후 있기 때문에 이러한 분자 정자 생존 및 다 산8에 대 한 단점으로 인정을 받고 있다 중요 하다. 또한, 셀 내에 선생님의 배급을 공부 하 고 손상의 정도 추정 하는 것 중요 한 수 있습니다. 예를 들어, 정상 및 정자 기능, 호환 되는 미토 콘 드리 아에서 선생님의 낮은 수준의 추측 될 수 있지만 핵 내 선생님의 높은 수준의 정 충 DNA 손상의 지표 수 있습니다. H2O2 는 미토 콘 드리 아에서 나올 수 있는 작고 충전 없는 분자9이기 때문에 핵을 관통 하는 가장 관련성이 높은 선생님 중 하나입니다. Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-다) 특히 녹색 형광을 방출 하는 세포내 과산화물을 밝힐 수 있다. 이 문서에서는, Solea senegalensis 정자 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 H2O2 세포내 지역화를 탐지 하기 위한 상세한 프로토콜 제공 됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
그것은 잘 알려진 미토 콘 드리 아는 정자의 운동 성 및 기능에 대 한 주요 세포입니다. 이러한 세포는 동시에 직접 선생님 생산에 참여 했다. 흥미롭게도, 선생님의 제어 수준은 적절 한 정자 기능1필요 합니다. 다 산과 산화 스트레스 사이의 긍정적인 관계 포유류11 에 표시 되었습니다 하지만 과도 한 수준에 영향을 미칠 정자 품질12. 긍정적 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 AQUAGAMETE FA 1205 비용 작업을 감사합니다. 이 작품 AGL201568330-c 2-1-R 프로젝트 (MINECO/페더)에 의해 재정적으로 지원 되었다. 데이비드 G. 발 카 르 세 드 의회에 의해 투자 되었다 카스 티 야와 레온 (EDU1084/2012)와 Fondo 사회 Europeo. 저자는 박사 아나 Riaza 및 Stolt 바다 농장 소화기, 닥터 폴 리 드 파스, 박사가 그 나 시오 마르티네스 몬테로 호세 라몬 Guiérrez 인정합니다. 우리 또한 videography 폴라 페르난데스 Colado 감사.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
Riferimenti
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O’Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
- Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).
- Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
- Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
- Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
- Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
- Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function–in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
- Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
- Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
- Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).
