Évaluation de la localisation intracellulaire des espèces réactives de l’oxygène dans les spermatozoïdes de Solea Senegalensis
Summary
Ce protocole décrit une méthodologie détaillée pour détecter H2O2 localisation au sein de spermatozoïdes Solea senegalensis en utilisant un fluorochrome sensible DHFC-DA ROS, une tache de mitochondries direct des mitochondries et DAPI pour les noyaux visualisation, respectivement. Le protocole est conçu pour être effectuée dans les 2 h avec spermatozoïdes fraîches ou décongelées.
Abstract
Le stress oxydatif est l’un des facteurs importants en diminuant la qualité du sperme. Élaboration de protocoles efficaces pour la détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) de spermatozoïdes est très important dans toutes les espèces, mais ces méthodes sont rarement utilisés et encore moins en téléostéen. Cryoconservation est une technique utile en aquaculture à des fins différentes, y compris les banques de gènes et garanti la disponibilité de sperme tout au long de l’année. Procédures de gel/dégel pourrait causer la production de ROS et endommagent les cellules de sperme. Étant donné que les éventuels dommages qu’un excès de production de ROS pourrait provoquer dans les spermatozoïdes selon leur localisation, ici une méthodologie détaillée pour détecter H2O2 et évaluer sa localisation intracellulaire par microscopie confocale est fourni. À cette fin, une combinaison des 3 fluorochromes (2′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacétate (DHFC-DA), une tache de mitochondries direct et 4′, dichlorhydrate de 6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI)) sont utilisées pour évaluer la co-localisation de H2O2 avec des noyaux de spermatozoïdes ou de mitochondries dans les échantillons de sperme de Solea senegalesis .
Introduction
La production d’espèces réactives de l’oxygène a été liée à la qualité du sperme récemment1. Bien que la production de ROS dans les mitochondries peut être considéré comme un processus physiologique normal, le stress oxydatif par un excès de production de ROS est une cause évidente de dommages dans les spermatozoïdes à différents niveaux. Chez l’humain, le stress oxydatif est associé à l’infertilité masculine, altérant la motilité et la possibilité de subir une capacitation des2; chez les mammifères, changement d’intégrité de l’ADN dans les échantillons de sperme congelé a été également lié à la synthèse de H2O23.
Cryoconservation est une technique courante pour gène bancaire en aquaculture. Cette technologie est particulièrement importante chez les espèces avec des problèmes de reproduction telles que Solea senegalensis. Cette espèce précieuse sur le marché montre un dysfonctionnement reproductif chez les individus nés en captivité en raison du manque de parade nuptiale. Ce fait rend la cryoconservation du sperme nécessaire d’avoir la disponibilité de sperme pour la fécondation artificielle. Toutefois, la cryoconservation pourrait être une source de stress oxydatif qui pourrait être néfaste pour les spermatozoïdes4 car des études ont révélé un effet bénéfique de la supplémentation en antioxydants. Inhibition de ROS par antioxydant mitochondrial ciblée est aurait été bénéfique pour la cryoconservation de sperme dans le poisson-chat jaune5.
Par conséquent, les niveaux de ROS dans les échantillons de sperme sont importants de savoir, surtout après cryoconservation6,7 , parce que ces molécules ont été reconnues comme un inconvénient pour la survie de sperme et fertilité8. En outre, étudier la distribution des ROS dans les cellules pourrait être crucial d’en déduire le niveau des dégâts potentiels. À titre d’exemple, on pouvait supposer des niveaux faibles de ROS dans les mitochondries normales et compatible avec la fonction spermatique, mais des niveaux élevés de ROS dans le noyau pourraient être indicateurs de dommages à l’ADN les spermatozoïdes. H2O2 est l’un des plus pertinents br qui pourraient être libérées de la mitochondrie et pénètrent le noyau parce que c’est une petite molécule sans frais9. Diacétate de dichlorofluorescéine (DHFC-DA) peut révéler spécifiquement intracellulaire peroxyde émettant une fluorescence verte. Dans cet article, un protocole détaillé pour détecter la localisation intracellulaire de H2O2 dans Solea senegalensis spermatozoïdes au microscope confocal est présenté.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est bien connu que les mitochondries sont des organites essentiels pour le fonctionnement et la motilité des spermatozoïdes. Ces organites sont simultanément directement impliqués dans la production de ROS. Fait intéressant, les niveaux contrôlées des BR sont nécessaires pour sperme bonne fonction1. Des relations positives entre la fertilité et stress oxydatif ont été montrées dans les mammifères11 , mais un taux excessif affecte sperme qualité<sup class="x…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions l’Action COST AQUAGAMETE FA 1205. Ce travail a été soutenu financièrement par le projet AGL201568330-C2-1-R (MINECO/FEDER). David G. Valcarce a été financé par la Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) et Fondo sociale Europeo. Auteurs reconnaissent le Dr Ana Riaza et Stolt Sea Farm S.A., m. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero et José Ramón Guiérrez. Nous remercions également Paula Fernández Colado vidéographie.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
Riferimenti
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