Identificatie van Plant Ice-bindende eiwitten Through Beoordeling van Ice-herkristallisatie inhibitie en isolatie met behulp van Ice-affiniteitszuivering

Ice-bindingseiwitten (IBP) zijn een diverse familie van beschermende eiwitten die zijn ontdekt in een aantal organismen, waaronder planten ^{1, 2} insecten, vissen ³ en ⁴ microben. Het belangrijkste kenmerk van deze eiwitten is hun unieke mogelijkheid om gericht en efficiënt adsorberen aan ijskristallen, het wijzigen van hun groei. IBP meerdere gedocumenteerde eigenschappen, met de twee meest kenmerk dat thermische hysterese (TH) en ijs herkristallisatie inhibitie (IRI). TH activiteit gemakkelijker waargenomen IBP geproduceerd in freeze-intolerant dieren. Deze activiteit leidt tot verlaging van het vriespunt van de bloedsomloop of interstitiële vloeistoffen organismen om bevriezing te voorkomen. Dit in tegenstelling tot freeze-tolerante organismen, wat onvermijdelijk zal bevriezen bij temperaturen onder het vriespunt, IBP's lijken te laag TH activiteit hebben. Ondanks de lage TH activiteit, een hoge IRI activiteit ijsk beperkenstal groei wordt vaak waargenomen met deze eiwitten. Voor de freeze-tolerante organisme, dit IRI activiteit waarschijnlijk helpt cellen tegen de ongecontroleerde groei van ijs in extracellulaire compartimenten.

De "matras toets" model kan worden gebruikt om het mechanisme waarmee IBP de groei van ijskristallen ⁵ beschrijven. In dit model IBP specifiek te adsorberen aan het ijskristal aanbrengen met tussenafstanden, zodat watermoleculen alleen nemen de groeiende ijs kristalrooster in de ruimte tussen gebonden IBP. Hierdoor ontstaat een kromming die de opname van extra watermoleculen ongunstig maakt, een gebeurtenis die kan worden beschreven door de Gibbs-Thomson effect ^6. De verankerde water clathraat hypothese verschaft een mechanisme voor de specifieke binding van IBP aan het ijskristal oppervlak waardoor de aanwezigheid van geladen residuen, in het bijzonder geplaatst op het eiwit bindingsplaats ijs, resulteert in de reorganisatie watermoleculen zodat ze overeenkomen met een of meer vlakken van het ijskristal rooster ^7.

TH activiteit kan worden gekwantificeerd door het verschil tussen de smelt- en vriespunt van een ijskristal in aanwezigheid van een IBP. Terwijl TH-activiteit is een algemeen aanvaarde methode voor het evalueren van de activiteit van IBP, de lage TH spleet geproduceerd door planten IBP (typisch slechts een fractie van een graad) gewoonlijk een hoge eiwitconcentratie, gespecialiseerde apparatuur en bestuurderservaring. Hoewel niet-IBP ijs kristalgroei beperken, is een eigenschap die door alle IBP en dus testen op IRI Activiteit effectief startscherm voor de aanwezigheid van IBP, met name voor de lage TH activiteit. De gebruikte deze activiteitstest methodologie is bekend als een 'splat assay', waarbij een eiwitmonster wordt snel ingevroren op een monolaag van kleine ijskristallen, die worden gemeten over een tijdsperiode te bepalen of producerenijs kristalgroei beperkt. In tegenstelling tot andere methoden om een ​​bron weefselmonster op de aanwezigheid van IBP screenen Deze techniek is toepasbaar op lage eiwitconcentraties in het traject van 10-100 ng, gebruik gemakkelijk vervaardigde materiaal en genereert data die snel en gemakkelijk wordt geïnterpreteerd. Het is echter belangrijk te benadrukken dat deze test geeft een eerste scherm IBP die moet worden gevolgd door het bepalen van TH en ijskristal vormen.

De isolatie van natieve eiwitten is een uitdaging, waarvoor vaak informatie met betrekking tot de structurele en biochemische eigenschappen van een eiwit van belang. De affiniteit van IBP ijs maakt de isolatie van deze eiwitten met behulp van ijs als substraat voor zuiveringsdoeleinden. Aangezien de meeste moleculen vóór het ijswater begrenzing geduwd tijdens de groei van ijskristallen, trage groei van een ijs-halfrond in aanwezigheid van een IBP monster resulteert in een zeer gezuiverd monster, zonder grote quantitven van verontreinigende proteïnen en opgeloste stoffen. Deze werkwijze is gebruikt om IBP identificeren insecten ^{8, 9, 10, 11} bacteriën, vissen en planten ^{12 13 14.} Daarnaast is de IBP-verrijkte fracties die met deze werkwijze kan ook worden gebruikt voor downstream biochemische analyse. Dit document beschrijft de identificatie van IBP in planten via de inductie en extractie van IBP, analyse van IRI activiteit de aanwezigheid van eiwitten, en de isolatie van eiwitten met behulp van ijs affiniteitzuivering bevestigen.