Identificación de proteínas vegetales de hielo de unión a través de la evaluación de la inhibición de hielo-recristalización y Aislamiento Uso de purificación de hielo-afinidad
Summary
Este documento describe la identificación de proteínas de unión de hielo a partir de plantas tolerantes a la congelación a través de la evaluación de la actividad de inhibición de hielo-recristalización y posterior aislamiento de IBP nativas utilizando purificación hielo-afinidad.
Abstract
proteínas de unión de hielo-(IBP) pertenecen a una familia de proteínas inducidas por estrés que se sintetizan por ciertos organismos expuestos a temperaturas bajo cero. En las plantas, daños por congelación se produce cuando crecen los cristales de hielo extracelular, dando como resultado la ruptura de las membranas de plasma y posible muerte celular. Adsorción de IBP a cristales de hielo restringe aún más el crecimiento mediante un proceso conocido como inhibición de hielo-recristalización (IRI), reduciendo así el daño celular. IBP también demuestran la capacidad de deprimir el punto de una solución por debajo del punto de fusión de equilibrio, una propiedad conocida como histéresis térmica actividad (TH) de congelación. Estas propiedades de protección han elevado interés en la identificación de nuevos IBP debido a su uso potencial en aplicaciones industriales, médicas y agrícolas. Este artículo describe la identificación de la planta de IBP a través de 1) la inducción y la extracción de IBP en el tejido vegetal, 2) la proyección de extractos para la actividad IRI, y 3) el aislamiento y la purificación de IBP. Después de la inducción de IBP por la exposición a baja temperatura, extractos se ensayaron para la actividad IRI utilizando un 'ensayo de splat', que permite la observación del crecimiento de cristales de hielo usando un microscopio de luz estándar. Este ensayo requiere una baja concentración de proteína y genera resultados que se obtienen de forma rápida y fácil de interpretar, proporcionando una pantalla inicial para la actividad de unión de hielo. IBP luego puede ser aislado de proteínas contaminantes mediante la utilización de la propiedad de IBP para adsorber al hielo, a través de una técnica llamada 'hielo-purificación de afinidad'. Usando lisados de células recogidas de extractos de plantas, un hemisferio hielo puede cultivar lentamente en una sonda de latón. Esto incorpora IBP en la estructura cristalina del hielo policristalino. Que no requiere un conocimiento bioquímico o estructural a priori de la IBP, este método permite la recuperación de proteína activa. fracciones de proteína de hielo purificados se pueden utilizar para aplicaciones posteriores, incluyendo la identificación de pepsecuencias de marea por espectrometría de masas y el análisis bioquímico de proteínas nativas.
Introduction
Proteínas de unión de hielo-(IBP) son una familia diversa de proteínas protectoras que se han descubierto en una serie de organismos, incluyendo plantas 1, insectos, peces 2 3 y microbios 4. La característica clave de estas proteínas es su capacidad única para adsorber específicamente y eficazmente a los cristales de hielo, la modificación de su crecimiento. IBP tienen varias propiedades documentados, con los dos más bien caracterizado ser histéresis térmica (TH) y la inhibición de hielo-recristalización (IRI). actividad TH se observa más fácilmente en IBP producidos en animales de congelación-intolerante. los resultados de esta actividad en disminución del punto de fluidos circulatorios o intersticiales organismos congelación para evitar la congelación. En contraste, en los organismos de congelación-tolerante, lo que inevitablemente congelar a temperaturas bajo cero, IBP parecen tener baja actividad de TH. A pesar de la baja actividad de TH, una alta actividad IRI para restringir grito hielocrecimiento Stal se observa a menudo con estas proteínas. Para el organismo tolerante a la congelación, esta actividad IRI presumiblemente ayuda a proteger las células contra el crecimiento descontrolado de hielo en compartimentos extracelulares.
El modelo de "botón de colchón" se puede utilizar para describir el mecanismo por el cual IBP a prevenir el crecimiento de cristales de hielo 5. Bajo este modelo, IBP adsorber específicamente a la superficie de cristales de hielo a intervalos, de manera que las moléculas de agua sólo pueden incorporar con la creciente enrejado de cristales de hielo en el espacio entre unido IBP. Esto crea una curvatura que hace que la incorporación de moléculas de agua adicionales desfavorable, un evento que puede ser descrito por el efecto de Gibbs-Thomson 6. Las aguas de clatrato anclado hipótesis proporciona un mecanismo para la unión específica de IBP a la superficie del cristal de hielo lo que la presencia de restos cargados, colocado específicamente en el sitio de unión de hielo proteína, los resultados en la reorganización de moléculas de agua para que coincidan con uno o más planos de la red cristalina de hielo 7.
actividad TH puede ser cuantificado mediante la medición de la diferencia entre la fusión y las temperaturas de congelación de un solo cristal de hielo en presencia de un IBP. Mientras que la actividad TH es un método ampliamente aceptado de evaluación de la actividad de IBP, la brecha TH bajo producido por la planta de IBP (típicamente sólo una fracción de grado) normalmente requiere una concentración de proteína alta, equipo especializado y experiencia del operador. Aunque no IBP puede restringir el crecimiento de cristales de hielo, es una propiedad compartida por todos los IBP y probar de este modo para la actividad IRI es una pantalla inicial eficaz para la presencia de IBP, especialmente para aquellos con baja actividad de TH. La metodología utilizada para probar esta actividad se conoce como un 'ensayo de splat', mediante el cual una muestra de proteína se congelaron rápidamente para producir una monocapa de pequeños cristales de hielo, que se observan durante un período de tiempo para determinar siel crecimiento de cristales de hielo está restringido. A diferencia de otros métodos utilizados para escrutar una muestra de tejido fuente para la presencia de IBP, esta técnica es aplicable a bajas concentraciones de proteínas en el intervalo de 10-100 ng, utiliza equipos fácilmente-fabricada, y genera datos que se interpreta de forma rápida y fácil. Sin embargo, es importante subrayar que este ensayo proporciona una pantalla inicial para IBP que debe ser seguido por la determinación de TH y la conformación de cristales de hielo.
El aislamiento de proteínas nativas es un reto, a menudo requieren información sobre las propiedades estructurales y bioquímicas de una proteína de interés. La afinidad de IBP para el hielo permite el aislamiento de estas proteínas usando hielo como un sustrato para fines de purificación. Puesto que la mayoría de las moléculas son empujados por delante del límite de hielo-agua durante el crecimiento de cristales de hielo, el crecimiento lento de un hielo-hemisferio en presencia de una muestra de IBP resultados en una muestra altamente purificada, desprovisto de gran quantitIES de proteínas contaminantes y solutos. Este método ha sido utilizado para identificar IBP de los insectos 8, 9, 10, las bacterias 11, peces 12 y las plantas 13, 14. Además, las fracciones enriquecidas en IBP obtenidos a través de este método también se pueden utilizar para el análisis bioquímico de aguas abajo. Este documento describe la identificación de IBP en las plantas a través de la inducción y la extracción de IBP, análisis de la actividad IRI para confirmar la presencia de proteínas, y el aislamiento de proteínas utilizando la purificación por afinidad de hielo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para el análisis exitoso y purificación de IBP, es importante para comprender la naturaleza sensible a la temperatura de algunas de estas proteínas. Cierta planta IBP vuelva inestable a temperaturas superiores a 0 ° C, resultando en despliegue, la precipitación y la inactividad. Con el fin de obtener IBP activos, a menudo es crítico que las plantas se procesan en una habitación fría (~ 4 ° C) y las muestras se mantuvieron en hielo durante la experimentación. Otro factor a considerar cuando se utiliza de célul…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una beca NSERC (Canadá) a VKW.
Materials
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/ camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
Riferimenti
- Sidebottom, C., et al. Heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256 (2000).
- Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
- Davies, P. L., Hew, C. L. Biochemistry of fish antifreeze proteins. FASEB J. 4 (8), 2460-2468 (1990).
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).
- Yeh, Y., Feeney, R. E. Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function. Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).
- Smolin, N., Daggett, V. Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein. J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).
- Graham, L. A., Davies, P. L. Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas. Science. 310 (5747), 461 (2005).
- Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova. J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).
- Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity. PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).
- Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L. Hyperactive antifreeze protein in a fish. Nature. 429 (6988), 153 (2004).
- Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants. Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).
- Gupta, R., Dreswal, R. Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant. Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).
- Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice. Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).
- Middleton, A. J., et al. Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants. Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).
- Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. J. , (2016).
- Olijve, L. L., et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).
- Zakharov, B., et al. Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study. J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).
- Capicciotti, C. J., et al. Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations. Sci. Rep. 5, 9692 (2015).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues. Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).
- Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L. Ice-shell purification of ice-binding proteins. Cryobiology. 72 (3), 258-263 (2016).
- Basu, K., et al. Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).
- Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses. BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
