Summary

분리 및 소설 표면 마커 조합에 의해 확인 된 간 전구 부분 집합의 농축

Published: February 18, 2017
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Summary

간 손상은 이종 세포 인구를 나타내는 전구 세포의 확장을 동반한다. 이 세포 구획의 소설 분류는 여러 부분 집합의 구별이 가능합니다. 여기에 설명 된 방법은 추가 분석 및 분석에 사용될 수있는 다양한 서브 세트의 고순도 분리 계측법 흐름을 도시한다.

Abstract

만성 간 손상 동안 전구 세포는 염증 세포의 침윤과 상피 세포 활성화의 모양을 수반 ductular 반응이라는 프로세스에 확장. 이러한 염증 반응 동안 전구 세포 인구는 대부분 조직 학적 분석이나 유동 세포 계측법 기반 기술에 의해 하나, 하나의 표면 마커를 사용하여 조사되었다. 그러나, 새로운 표면 마커가 간 전구 내에서 다양한 기능적으로 별개의 하위 집합을 식별 / 셀 구획 줄기. 여기에 제시된 방법은 분리 및 신규 표면 마커의 조합을 사용하여 선조 세포 계측법 분석 서브 세트의 상세한 흐름을 설명한다. 또한, 다양한 전구 세포 서브셋 고순도 자기 자동화 사용하여 FACS 정렬 기반의 방법으로 분리 될 수 있는지 보여준다. 중요한 간 새롭고 단순화 분해 효소는 높은 생존력 이러한 희귀 세포군의 분리를 허용즉 기존의 방법에 비해 우수하다. 이는 시험관 내에서 상기 전구 세포 연구 또는 유전자 발현 프로파일을 분석하는 고품질의 RNA를 분리하는 데 특히 적합하다.

Introduction

간 재생 주로 간세포의자가 재생산 능력과 관련된다. 그럼에도 불구하고, 만성 간 손상은 간세포 및 담관 1, 2, 3, 4로 분화 할 수있는 능력과 관련이있는 전구 세포 활성화 및 확장으로 발생한다. 만성 상처 중에 간세포 증식 효과가없는 경우가 있기 때문 특히 적합하다. 전구 세포를 표적 다중 유전자 추적 연구에도 불구하고, 간 재생에서의 역할은 5, 6, 7, 8 논란이 남아있다. 또한, 전구 세포의 활성화는 부상 9시 자신의 정확한 역할에 대한 질문을 제기 간에서 증가 섬유 성 반응에 연결되어 있습니다10.

선조 세포 구획의 이질적인 성질 긴 미세 절제 또는 세포 분류 기반의 방법 (1) (11)를 사용하여 단일 표면 마커를 발현하는 전구 세포를 격리 유전자 발현의 연구에 의해 제안되고있다. 실제로, 최근 새로운 표면 마커 조합하여 gp38 (podoplanin)는 명백하게 다양한 서브 세트들 (12) 선조 세포의 이전 단일 마커 링크. 중요한 것은, 이러한 서브 세트는 그들의 표면 마커의 발현에 차이가없는 아니라 부상 12시 기능적 변화를 나타냈다.

여러 동물 모델은 전구 세포의 활성화, 간 재생을 조사하기 위해 사용되어왔다. 다양한 부상 유형은 전구 세포 (12)의 하위 집합을 서로 다른의 활성화를 촉진 것으로 보인다. 이는 pH를 설명 할 수있을인간 4에서 관찰 ductular 반응 enotypic 발산. 따라서, 전구 세포의 표현형 복잡한 기능적 분석은 부상 역할 및 간 질환의 ductular 반응의 참된 의미를 이해하는 피봇된다.

표면 마커 조합 외에, 세포 격리 프로토콜의 중요한 차이는 또한 이전의 연구 (2)에 기초하여 결론을 복잡. 연구의 상당한 양을 크게들이 분리 프로토콜 상이한 전구 세포 (예, 간 분리 (효소 결합 프로세스의 기간), 밀도, 매질 및 원심 분리 속도)의 역할이 해결. 최적화 된 분리 기술, 희귀 세포 집단에 대한 더 나은 가능성을 제공하고 일부 조성물의 반사가 개발하고 최근 12 게시되었습니다. 이 문서의 목적은 더 DET을 제공하는 것입니다이 간세포 분리 절차 및 일부 분석 ailed 프로토콜 기술의 적절한 재생을 허용한다. 또한, 프로토콜은 새로운 프로토콜과 비교하여 차이를 설명하기 이전의 분리 방법과의 비교를 포함한다.

Protocol

모든 실험 절차 부르크 대학 의료 센터의 윤리와 동물 관리위원회의 승인을 실시 하였다. 재료 및 버퍼의 1. 준비 갓 세균 오염을 방지하기 위해 살균 성분 및 층류 후드를 사용하여 간 소화에 필요한 모든 버퍼를 준비한다. RPMI 배지 49.5 mL의 소 태아 혈청 0.5 mL를 혼합하여 수집 버퍼 (CB)를 준비 (FBS를 낮은 독소는 열 불 활성화)를 1 % (v / v)의 용액을 달성하기 위…

Representative Results

실질 비 실질 간세포 (도 1 및도 2a)를 포함하는 단일 세포 현탁액 효소 결과의 신규 한 혼합물을 사용하여 간 소화 여기 제시된 방법. 적혈구의 ACK-용균 후, 단일 세포 현탁액 계측법 분석 직접적인 유동이 가능 (도 1 및 2)이다. 게이팅 전략은 이중선과 죽은 세포 (그림 2a)의 배제를 포함한다. CD45, CD31, 및 ASGPR1 ?…

Discussion

간 염증과 다른 기원의 부상 전구 세포 확장 및 활성화 2, 3을 동반하는 간에서 재생 프로세스를 트리거합니다. 이러한 간 전구 세포는 세포의 특성을 가지고 줄기 가능성 각종 간 질환의 pathomechanism에서 중요한 역할을한다.

간 전구 세포의 이질성 오랫동안 제안되어왔다. 다른 표면 마커를 운반 서브 세트를 식별하고 간 손상 <sup cl…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 VLK에 알렉산더 폰 훔볼트 재단 Sofja Kovalevskaja 수상에 의해 지원되었다.

Materials

RPMI Life Technologies 21875-034
phenol red free DMEM Life Technologies 31053-028
FBS Life Technologies 10270-106
Collagenase P Sigma-Aldrich 11249002001
DNAse-I Sigma-Aldrich 10104159001
Dispase Life Technologies 17105041
ACK Lysing Buffer Life Technologies A10492-01
HBSS Life Technologies 14025-050
PBS Sigma-Aldrich D8537
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002 Prepare 1 % stock solution
10 % BSA Miltenyi Biotec 130-091-376
autoMACS Rinsing Solution Miltenyi Biotec 130-091-222 add 0.5 % (v/v) BSA and store on ice
Phenol-red free DMEM Sigma-Aldrich D1145
counting Beads Count Bright Life Technologies C36950
PI Miltenyi Biotec 130-093-233
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec 130-092-575
anti-CD31 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-097-418
anti-CD45 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-301
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485
CD64 Purified BioLegend 139302 Dilution: 1:100
CD16/32 Purified BioLegend 101302 Dilution: 1:100
CD45 APC/Cy7 BioLegend 103116 Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells
CD31 Biotin BioLegend 102504 Dilution: 1:200, marks endothelial cells
ASGPR1 Purified Bio-Techne AF2755-SP Dilution: 1:100, marks hepatocytes
Podoplanin APC BioLegend 127410 Dilution: 1:1400, marks progenior cells
Podoplanin Biotin BioLegend 127404 Dilution: 1:1400
CD133 PE Miltenyi Biotec 130-102-210 use 3 µl, marks progenitor cells
CD133 Biotin BioLegend 141206 Dilution: 1:100
CD34 Biotin eBioScience 13-0341-81 Dilution: 1:100
CD90.2 Pacific Blue BioLegend 140306 Dilution: 1:800
CD157 PE BioLegend 140203 Dilution: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421 BioLegend 118225 Dilution: 1:100
Sca-1 Biotin Miltenyi Biotec 130-101-885 use 10 µl
Mouse IgG2b, κ PE BioLegend 400311
Rat IgG1 PE BioLegend 400407
Rat IgG2b, κ APC/Cy7 BioLegend 400624
Rat IgG2a, κ Biotin BioLegend 400504
Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 BioLegend 400535
Syrian Hamster IgG APC BioLegend 402012
Syrian Hamster IgG Biotin BioLegend 402004
Normal Goat IgG Control Purified Bio-Techne AB-108-C
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 Life Technologies A11055 Dilution: 1:800
Streptavidin Alexa Fluor 405 Life Technologies S32351 Dilution: 1:400
100 µm Filter mesh A. Hartenstein PAS3
LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACS separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACSQuant Analyzer 10 Miltenyi Biotec 130-096-343
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
FACS AriaTMIII BD Biosciences
FACSDiva sofware BD Biosciences
Polypropylene Round bottom tube Falcon 352063
Rneasy plus mini kit Qiagen 74134 RLT lysis buffer is included

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Julich-Haertel, H., Tiwari, M., Mehrfeld, C., Krause, E., Kornek, M., Lukacs-Kornek, V. Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination. J. Vis. Exp. (120), e55284, doi:10.3791/55284 (2017).

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