使用成像流式细胞仪T细胞同种异体反应性测定

1.准备试剂和材料要求制备含有2％胎牛血清（FBS）（“洗涤缓冲液”）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。用含有0.1％非离子型洗涤剂2％FCS的PBS制备（“烫发洗涤缓冲液”;见材料的表）。用1.5％的甲醛制备PBS。 注意：小心！甲醛具有腐蚀性，可能致癌，并佩戴适当的个人防护装备必须被处理。 制备含有2％FBS和0.5mM乙二胺四乙酸（EDTA），用于磁性细胞分离（“MCS缓冲液”）的PBS。 制备50微克在二甲亚砜/ mL的鬼笔环肽 – 荧光素异硫氰酸酯（鬼笔环肽-FITC）（DMSO）。制备1mg / mL的核染色（ 例如，1毫克/在DMSO或双-苯甲亚胺染料毫升7氨基放线菌素D（7-AAD）;见材料的表）的DMSO。准备适合于感兴趣的细胞荧光染料标记的抗体和成像流式细胞仪。 获得动物组织（ 例如，淋巴结和脾）和作为抗原呈递细胞或祖细胞的来源T细胞和异基因动物组织（ 例如，脾和骨髓）的源极。 制备细胞培养基（ 例如，的Roswell Park Memorial Institute培养基（RPMI）1640或Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM），补充有10％FBS），50μM2-巯基乙醇，青霉素和链霉素和获得24-和/或96-孔细胞培养板。 2.准备抗原呈递细胞 注：从理论上讲，任何APC人口可能用这种方法进行检查。未成熟的小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC）作为APC是在这种情况下起诉。许多协议存在用于产生这些细胞（例如，参考文献34和35）。简言之，使用以下方案。 从股骨和胫骨成RPM冲洗骨髓我1640或DMEM。 通过悬浮的细胞通过70-μm的细胞过滤器以去除小骨片和碎屑。 沉淀通过离心细胞，然后用氯化铵缓冲液，在室温下5分钟裂解红细胞。 沉淀通过离心（400×g下，5分钟）将细胞重悬细胞沉淀。 洗涤细胞在5 – 10毫升洗涤缓冲液，沉淀物通过离心（400×g下，5分钟），并再悬浮细胞沉淀。 通过标记与生物素化的抗CD3（5μg/ mL的），抗B220（5微克/毫升），抗MHC II类（1微克/毫升），和抗CD11b的细胞富集在细胞分离柱的造血前体（5微克/毫升）的抗体。 通过离心（400×g下，5分钟）沉淀细胞并再悬浮细胞沉淀。 孵育用抗生物素磁性微珠（参见材料的表）将细胞在4℃下进行10分钟。 洗涤和沉淀细胞（400×g下，5分钟），然后重新suspenð他们在1个MCS毫升缓冲液使用大正选择去除所述标记的细胞用3mL缓冲MCS的引发和放置在其磁铁（LS）磁性细胞分离柱之前。用3mL缓冲MCS的洗涤柱3次;的流过将包含期望的细胞。 培养通过该柱通过6天在RPMI 1640或DMEM将细胞用补充有2毫微克/毫升的重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和2纳克/重组人转化生长因子β1的毫升（TGFβ1） 。每2天用含有2毫微克/毫升GM-CSF和TGFβ1新鲜的完全培养基替换一半培养基。 注：人TGF-β1具有活性的小鼠细胞。数据一直在使用这些未成熟DC产生。其他细胞（ 例如，B细胞和成熟DC）可以是适合作为APC，但尚未在该测定中进行测试。 冷冻保存的DCs在90％血清/ 10％DMSO中，并存储在液氮;恢复上使用的当天。在使用之前，使用台盼蓝排除计数血球可行DC的数量。在适当的密度重悬在培养基中的细胞沉淀（参见步骤4.1）在第4在使用前。 3.准备性T细胞使用阴性选择方法，以避免无意中发送激活或抑制性信号到细胞中。 注意：在这个例子中，CD4 + T细胞被准备用于分析。 从小鼠脾制备CD4 + T细胞，通过使用注射器的柱塞一个70微米的细胞过滤醪脾脏。洗用洗涤缓冲液的细胞滤网。 沉淀通过离心悬浮细胞（400×g下，5分钟），然后通过重新悬浮于氯化铵缓冲液将沉淀在室温下5分钟裂解红细胞。 通过离心（400×g下，5分钟）沉淀细胞并重新悬浮沉淀。 洗净细胞S IN 5 – 10毫升洗涤缓冲液和沉淀物的通过离心（400×g下，5分钟）。重新悬浮沉淀。 染色用生物素化抗体对CD8，主要组织相容性复合物II类（MHC II，1微克/毫升），和CD19（5微克/毫升）的细胞。孵育在4℃下10分钟。 清洗细胞在10mL洗涤缓冲液和沉淀物的通过离心（400×g下，5分钟）。重新悬浮沉淀。 孵育用抗生物素磁性微珠（参见材料的表），根据制造商的指示细胞。 通过离心（400×g下，5分钟）清洗细胞在10mL洗涤缓冲液和沉淀物的;重新悬浮沉淀。 重悬在1mL MCS缓冲器的细胞和丰富的CD4 + T细胞在具有上的磁体3 MCS毫升缓冲液引发的磁性细胞分离柱。用3mL缓冲MCS的洗涤柱3次。柱流过将包含富集的T细胞。 通过标准流程cytome尝试，使用阴性选择细胞的等分试样评估T细胞的纯度。使用荧光染料的链霉亲缀合物（以确定应已在塔中除去任何生物素标记的细胞）和一种或多种抗体来识别感兴趣的T细胞群体（CD4在这种情况下）将细胞染色;的≥85％的纯度是可以接受的23。 通过锥虫蓝排除（≥90％生存力是可以接受的）计数血球的T细胞。 注：MCS缓冲液含有EDTA，必须在分析前除去。为了实现这一点，沉淀通过离心（400×g下，5分钟）将细胞和在1毫升洗涤缓冲液洗涤。再次沉淀细胞（400×g下，5分钟），并在适当的密度培养基重悬浮（参见步骤4.1）。 4.共孵育性T细胞和DC 在种子的T细胞和DC 2：1 T：DC比在24孔或96孔细胞培养板中。确保这件事最终培养体积为≤500μL用于24孔板或≤50μL96孔板中。 注：小的体积促进细胞间的相互作用，并允许后的位置固定的缓冲空间。 精确调节细胞数量经验性地，但作为一般指导，使用1×10个6个 T细胞和每孔（96孔板）0.5×10 6的DC。这些应被视为小区的最小数目，因为使用较少的细胞，使免疫困难突触的枚举。 以增加细胞数量，设置重复孔和池后步骤5（固定）。 注意：当设置重复孔，最好是种子的DCs在所有的孔的第一和然后种子T细胞在所有孔;这最大限度地减少在井之间孵育时间的差异。 在一个5％CO 2气氛中温育4个小时将板在37℃下。 e_title“> 5.修正在板状电池在PBS中添加3倍1.5％甲醛的培养物体积到各孔中并在室温下温育30分钟; TT重要的是要固定的细胞从板中除去它们以最小化细胞 – 细胞相互作用的破坏之前。 转移细胞在板成管用于随后的洗涤和染色。在该阶段，对于单染色对照预留附加细胞。除了这些控制，整个培养应与抗体混合物进行染色（参见步骤4.1.1）。 6.细胞染色在100μL含在室温下30分钟的所需荧光染料缀合的抗体的混合物的洗涤缓冲液的染色细胞，避光。 注：鸡尾酒包括T细胞特异性和APC特异性抗体。荧光染料的选择应使得它们可以使用成像的配置流式细胞仪来区分。在T这里示出他的实验中，蓝色荧光团偶联的CD11b（5微克/毫升，见材料的表）和APC缀合的CD90.2（5微克/毫升）使用。 清洗细胞在1mL洗涤缓冲液和离心分离机的5分钟，在400×g下。 倒出上清液。重悬在含有鬼笔环肽FITC烫发洗涤缓冲液将细胞在0.05-0.5微克/毫升孵育在室温下避光30分钟。 注：约0.1μg/ mL的鬼笔环肽的FITC浓度小鼠细胞工作良好，但是适当的浓度，预计由供应商，细胞类型而变化，并且成像流式细胞仪。 洗在1mL渗透/洗涤缓冲液和离心分离机的细胞在400×g下5分钟。倒出上清液。重悬在渗透/洗涤缓冲液含有适当浓度（ 例如，约25微克/毫升7-AAD）核染料将细胞孵育在室温下避光30分钟。 洗净细胞S IN 1毫升渗透/洗涤缓冲液和离心机在400×g下5分钟。倒出上清液。在洗涤缓冲液，沉淀物洗细胞一次，并在50个悬 – 洗涤缓冲液100微升，将细胞转移到小的，加盖的微量离心管。 进行到数据采集立即或细胞储存在长达数天前采集在成像流式细胞仪避光4℃。 注：细胞已经成功地以这种方式存储长达7天。更长的存储是可能的，但还没有经过测试。 7.采集数据初始化和配置根据制造商的说明流式细胞仪的成像流程。确保流动芯的稳定性收集任何数据之前。 预留明场图像获取一个信道。获得单染色控制数据与明场通道关闭。 点击“Load”按钮和樱雪室温含有完全染色的样本到保持器（已染色的所有必需的荧光染料的样品）的管。 在“工作区”窗口中，选择并创建具有纵横比在该区域以及栅极单峰新散点图，其中纵横比接近于1。创建（在水平轴强度的信道的）中使用的每个信道新的散点图。 对于每一个荧光染料，检查了积极的人口，如果需要，在“照明”框调整激光的电压。 卸载管并加载第一单染色管。 在“获取设置”框中，输入样品名称和设定将要收集的事件的数量;如果它是一个单一的染色（用于补偿控制），1000 – 2000事件是足够的。 在“频道”中，选择各样品已经染色与通道。对于单染色对照，所有信道应与brightf选择屈服和侧向散射掉。点击下的“收购”中的“录制”按钮;当事件的数量达到指定的阈值，采集将自动停止。 点击“返回”按钮来卸载管。重复步骤7.2.4 – 7.2.6对于每个单染色控制。取决于仪和软件，它可能无法将所有采集过程中在图1所示的门的（更多的是分析过程中进行精确的选通;参见第8部分）。 获得的样品作为用于单染色的样品（步骤7.2），但在“通道”中，选择所需的所有信道，包括明场通道。 记录数据之前，检查，以确认信道强度是合适的用于识别所期望的细胞群。如果不是，使用新的设置调整激光器设置，并重新记录单染色对照，如在步骤7.2中描述。 对于每一个样本采集活动的数万。 注：在大多数情况下，细胞-细胞接触事件是总细胞数（大部分是单电池）的一小部分。一般情况下，理想的是具有在最终的膜接触栅极至少100个事件。 8.分析数据分析在成像流式细胞仪使用可从制造商的网站免费分析软件获得的数据（的用户帐户必须创建;见材料的表）。 图1.门控策略用于鉴定反应免疫突触。 A.在聚焦事件从所有事件通过检查基于根细胞图像门控使用明场瓒意味着像强度分布（梯度RMS）的变化率的平方NEL（通道4，CH04），如文中所述。 B.在对焦事件，双重从单个细胞通过绘制纵横比与用于明场通道区域区分。单一细胞聚集接近1的纵横比，并且具有更小的面积，而双峰是接近0.5，并具有更大的面积。 温度 。的APC的荧光强度（在这种情况下，树突细胞[DC]标记，CD11c的）随后作图的T细胞标志物的荧光强度（在这种情况下，CD90.2），和双阳性事件被选通。门的边框可以通过查看边界附近活动的图像进行细化。然后D. T-APC双峰被细化，使得它们仅包含一个APC通过绘制纵横比相对于APC标记（CD11c的，CH02）的面积。然后E.这些单APC双峰被细化，使得它们通过标绘的纵横比与所述区域仅包含一个T细胞T细胞标记物的（CD90.2，CH06）。 F.最后，通过对核染色通道（7-AAD，CH05）绘制斑点计数的直方图和选通仅包含2 7-AAD阳性斑点（ 即，核）事件选择仅含有两个核事件。在该栅极中的事件进行了分析为膜接触和突触形成，如在图2中描述。以盲方式对数据进行分析对于治疗的分配，并从先前公布的实验23。 请点击此处查看该图的放大版本。 注：门控策略在本节中描述并在图1中示出。应以盲方式相对于治疗分配来执行成像流式细胞术数据的分析。虽然我们相信免疫突触和非synaptiC触点通常容易区分（见下文和图2和3），致盲应尽量减少从固有的图像分析的主观性所产生的偏差。 通过单污点控制数据文件加载到补偿向导生成补偿矩阵。装载单染色文件后，选择在实验中使用的荧光通道。 注：该软件自动产生一个补偿矩阵，但应手动验证，以确保选择正确的积极的群体。 双击矩阵中的值和图形添加到分析区域。如果有必要排除任何死细胞/双峰/误报创建一个新的门;这个新的成品阳性群体所用的基质框在下拉每个通道菜单中选择。 重复此对每个信道。 点击“完成”保存compensation矩阵（.ctm文件）。 通过装载.rif文件到分析软件和应用所述补偿矩阵获得从原始文件（.rif）中的数据分析文件（.daf）。 一旦数据被加载，执行选通，以确定T细胞的APC接触事件。 注意：典型的门控策略涉及识别对焦的事件，基于大小的标准（该区域相对于所述事件的纵横比），和选择双峰选择T细胞的APC双峰作为是双阳性的T细胞的事件和APC标记物（ 图1A-C）。 注意：纵横比是一个事件到其高度，这允许单个细胞的判别（比接近1）从双峰（比接近0.5）的宽度的比值。 通过绘制根指的是在明场通道（ 图1A）的成像强度分布（梯度RMS）的变化率的平方确定对焦事件。点击次È梯度RMS直方图，以显示个人箱细胞事件，然后将排除了焦事件的栅极。 绘制图形的区域相对于明场通道的纵横比和绘制基于事件的形状和尺寸（ 图1B）标识双峰的栅极。只是里面和这个门的境外活动图像的审查可以帮助分析师细化门的大小和位置。然后，构建体，其中所述的T细胞标记物的强度出现在一个轴和APC标记物的强度出现在其它这些双峰事件的曲线图。绘制包含事件均为阳性标记物的T-APC双峰栅极。 其中T细胞APC双重的事件，只包含一个T细胞和一个APC选择事件。 通过绘制纵横比与用于APC标记区域和通过门控上含有单一APC（ 图1D）双峰做到这一点。积的纵横比与区域的T细胞标记ER和栅极上含有单一的T细胞（ 图1E）的双峰。 注意：进一步改进可以通过与仅两个斑点（ 图1F）施加到核染色荧光和浇口上的事件标绘点计数功能的直方图来实现。 在一些情况下，双重峰中的两个小区将不会在接触;识别细胞相互接触，定义对象掩模APC和T细胞。 使用在分析菜单中的“模板”选项打开面罩管理器和定义一个新的面具。 输入名称，诸如“T细胞对象掩码。”点击“功能”按钮，在对话框中，选择“对象”。 选择在其中检测到T细胞标记物的信道（ 例如，CH06）。点击“确定”。 注：“对象（M06，CH06，紧）”显示在功能框。这种默认的对象模板通常WORKS很好，但可能需要优化。 重复此过程，以在适当的信道的APC对象掩码。 识别所述APC和T细胞的掩模后，确定由在对APC的荧光强度的APC对象模板在T细胞对象掩模绘制T细胞标志物的荧光强度的膜接触。在此图中，画出一个门，其仅包括在彼此接触的细胞。 注意：通常情况下，有相当明显的双阳性和双阴性群体（ 图2A）。 双阳性和双阴性群之间的边界可以通过查看在边界区域细胞的明视野图像，以确保细胞在接触是栅极内和细胞不接触被排除来设置。 在此阶段，手动检查该栅极内的事件的鬼笔环肽FITC图像来区分从简单的细胞 – 细胞接触成熟免疫突触。 üSE中的“标签图像”功能，以纪念这些图像。 注意：这个门内部标记的事件（免疫突触）的百分比，可以使用如在T细胞群直接同种异体反应性的指标正在研究中。