대상<em> 현장에서</em신진 효모에서> 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

네 개의 핵심 히스톤 단백질 H2A, H2B, H3 및 H4는 진핵 세포 염색체의 압축, 조직 및 기능에 중심 역할을한다. 이러한 히스톤 각각 두 세트의 궁극적 뉴 클레오 ^(1)의 형성의 결과로, 히스톤 옥타 자체 주변 DNA의 ~ 147 염기쌍의 감쌈 지시 분자의 스풀을 형성한다. 뉴 클레오 솜은 염색체 전체 유전자 전사의 조절과 euchromatin의 형성 및 이질 같은 염색체 기반 프로세스의 다양한 활성 참가자이며, 같은 과거 수십 년에 걸쳐 집중적 연구의 초점이되어왔다. 이러한 메커니즘은 히스톤 잔류의 번역 후 변형, ATP 의존적 인 뉴 클레오 리모델링 및 ATP 독립적 인 뉴 클레오 재구성을 포함 – 메커니즘의 수는있는 뉴 클레오는 특정 프로세스의 실행을 용이하게 할 수있는 방법으로 조작 할 수있는 기술되어있다조립 / 해체 ^{(2, 3).}

신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지는 진핵 생물에서 히스톤 함수의 이해에 특히 강력한 모델 생물이다. 이것은 주로 도메인 eukarya 걸쳐 히스톤 단백질의 진화 적 보전의 높은 유전 생화학 실험 다양 효모의 가공성에 기인 할 수있다 ^{(4)에 접근한다.} 효모 역방향 유전자 접근법 널리 염색질 생물학의 다양한 양상의 특정 히스톤 돌연변이의 효과를 연구하기 위해 사용되었다. 실험은 이러한 유형의 비정상적인 세포 (인해 세포에서 플라스미드의 수를 가변으로) 히스톤 단백질의 수준을 초래할 수 자율 플라스미드로부터 발현 같은 돌연변이 히스톤은 그 나라의 게놈 유전자좌로부터 발현 된 세포를 사용하는 것이 바람직하다 크로 엔의 수반 변경최종적으로 결과의 해석을 혼동 할 수 많은 환경.

여기서는 게놈 남은 외래 DNA 서열없이, 원하는 돌연변이 (들)의 발생에 클로닝 단계 및 결과를 필요로하지 않고 그 나라의 게놈 위치에서 히스톤 유전자 표적화 돌연변이 유발을 허용하는 PCR 계 기술을 설명한다. 이 기술은 효모에서 효율적인 상동 재조합 시스템을 활용하고 다른 그룹에 의해 개발 된 다른 유사한 기술과 공통점이 몇 가지 기능이있다 – 가장 특히 Delitto PERFETTO, 사이트 별 게놈 (SSG) 돌연변이 유발 및 복제없이 PCR 기반의 대립 유전자를 대체 방법 ^{5, 6, 7.} 그러나,이 설명 된 기술은 특히 히스톤 유전자의 돌연변이 유발에 적합하게 한 측면을 갖는다. 반수체 효모 세포에서, 네 개의 코어 히스톤의 각각은 두 개의 비 a로 인코딩llelic 높은 상 동성 유전자는 예를 들어, 히스톤 H3가 HHT1 HHT2 및 유전자에 의해 암호화되고,이 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF를는) 시퀀스의 90 % 이상 동일하다. 상 동성이 높은 수준은 구체적으로 돌연변이 유발을위한 두 개의 히스톤를 코딩하는 유전자 중 하나를 목표로 설계된 실험을 복잡하게 할 수 있습니다. 상기 방법들은 상동 재조합을 유도하는 표적 유전자의 ORF 내의 적어도 몇몇 시퀀스의 사용을 필요로하는 반면, 우리는 여기서 설명하는 기술에 대한 (더 적은 서열 상 동성을 공유하는) 히스톤 유전자의 ORF를 플 랭킹 서열을 이용한다 재결합 단계, 따라서 원하는 궤적에 돌연변이를 성공적으로 표적의 가능성을 증가시킨다. 또한, 재조합 드라이브 상동 지역이 더 효율적 대상 상동 재조합에 기여하고, 매우 광범위 할 수 있습니다.