ממוקד<em> באתרו</em> גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

ארבעת החלבונים היסטון הליבה H2A, H2B, H3, ו- H4 ממלאים תפקידים מרכזיים הדחיסה, ארגון ותפקוד של כרומוזומים איקריוטיים. שני סטים של כל אחד היסטונים אלה יוצרים את octamer היסטון, סליל מולקולרי שמנתב את העטיפה של זוגות בסיסים ~ 147 של DNA סביב עצמו, בסופו של דבר וכתוצאה מכך ההיווצרות של הנוקלאוזום ^1. נוקלאוזום הם משתתפים פעילים במגוון תהליכים מבוסס כרומוזום, כגון הסדרת שעתוק גנים לבין ההיווצרות של euchromatin ו heterochromatin פני הכרומוזומים, וככזה הוא העיקר של מחקר אינטנסיבי במהלך העשורים האחרונים. מספר המנגנונים תואר שבאמצעותו נוקלאוזום ניתן להשפיע בדרכים שיכולים להקל על ביצוע של תהליכים ספציפיים – מנגנונים אלה כוללים שינוי posttranslational של שאריות היסטון, שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP, וארגון מחדש הנוקלאוזום ATP-עצמאיוהרכבה / פירוק ^{2, 3.}

השמרים ניצני שמר האפייה הוא אורגניזם מודל חזק במיוחד להבנת תפקוד היסטון אאוקריוטים. זו ניתן לייחס במידה רבה את הרמה הגבוהה של שימור אבולוציוני של חלבונים היסטון ברחבי eukarya תחום רמת המוכנות של שמרים למגוון ניסיוני גנטיים ביוכימיים מתקרב ^4. גישות Reverse-גנטיות בשמרים היו בשימוש נרחב כדי לחקור את ההשפעות של מוטציות ספציפיות היסטון על היבטים שונים של ביולוגיה הכרומטין. עבור אלו סוגים של ניסויים הוא לעתים קרובות עדיף להשתמש בתאים בם ההיסטונים המוטציה באים לידי ביטוי מן הלוקוסים הגנומי מולדתם, כמו ביטוי מן פלסמידים אוטונומיים יכול להוביל לרמות תאיים החריגות של חלבונים היסטון (עקב מספרים שונים של פלסמידים בתאים) ו שינוי מקביל של הכרומטין environments, אשר בסופו של דבר יכול לבלבל את הפרשנות של תוצאות.

כאן אנו מתארים טכניקה PCR מבוססת המאפשרת mutagenesis הממוקד של גני היסטון במקומות גנומי מולדתם שאינו דורשים צעד שיבוט ותוצאות בדור של המוטציה הרצויה (ים) ללא רצפי DNA אקסוגני שאריות בגנום. טכניקה זו מנצלת את המערכה ההומולוגית היעילה שמרים ויש לו כמה תכונות משותפות עם בטכניקות דומות אחרות שפותחו על ידי קבוצות אחרות – בעיקר Delitto Perfetto, אתר ספציפי גנומי (SSG) mutagenesis, שיבוט ללא אלל מבוסס PCR שיטות החלפה ^{5, 6, 7.} עם זאת, הטכניקה נתאר יש היבט זה עושה את זה במיוחד מתאים היטב mutagenesis של גני היסטון. בתאי שמרים הפלואידים, כל אחד ההיסטונים הליבה ארבעה מקודד על ידי שתי שאינוגני llelic ו הומולוגיים מאוד: למשל, H3 היסטון מקודדים על ידי גני HHT1 ו HHT2, ואת מסגרות הקריאה הפתוחות (ORFs) משני הגנים הן מעל 90% זהות ברצף. רמה גבוהה זו של הומולוגיה יכולה לסבך ניסויים שנועדו למקד ספציפי אחד הגנים שני קידוד-היסטון עבור mutagenesis. בעוד השיטות הנ"ל לעתים קרובות דורשים שימוש לפחות כמה רצפים בתוך ORF של גן המטרה לנהוג הומולוגיים, הטכניקה שאנו מתארים כאן עושה שימוש רצפים איגוף ORFs של גנים היסטון (אשר חולקים הרבה פחות הומולוגיה ברצף) עבור צעד רקומבינציה, ובכך להגדיל את הסבירות של מיקוד המוצלח של mutagenesis אל המוקד הרצוי. יתר על כן, באזורים ההומולוגיים שמניעים רקומבינציה יכולים להיות מאוד נרחבים, ובכך תורמים עוד יותר הומולוגי ממוקדים ויעיל.