Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Ibrahim B. Durowoju; Kamaljit S. Bhandal; Jian Hu; Bruce Carpick; Marina Kirkitadze

doi:10.3791/55262

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochimica

Diferansiyel Taramalı Kalorimetre - Protein Antigen Termal İstikrar ve Yapısının Değerlendirilmesi Bir Yöntem

Published: March 04, 2017

doi:

10.3791/55262

Ibrahim B. Durowoju¹, Kamaljit S. Bhandal¹, Jian Hu¹, Bruce Carpick¹, Marina Kirkitadze¹

¹Analytical Research & Development,Sanofi Pasteur Limited

Summary

Diferansiyel tarama kalorimetrisi, bir proteinin denatüre edilmesi gerekli ısı geçiş sıcaklığına (ler) ve toplam ısı enerjisini ölçer. elde edilen sonuçlar, aşı formülasyonlarında protein antijenlerinin termal stabilitesini değerlendirmek için kullanılır.

Abstract

Diferansiyel tarama kalorimetrisi (DSC), sıcaklığın bir fonksiyonu olarak numunelerin molar ısı kapasitesini ölçer analitik bir tekniktir. Protein örnekleri durumunda, DSC profilleri termal stabilitesi hakkında bilgi ve bir ölçüde yapısal konformasyonunun değerlendirmek için kullanılabilen bir yapısal "parmak izi" olarak işlev görür. (T _m erime sıcaklığı) ve üçüncül yapısını stabilize etkileşimleri bozmak için gerekli olan enerji (entalpi, AH) proteinlerin Termal geçiş sıcaklığını ölçen bir diferansiyel tarama kalorimetresi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Karşılaştırmalar formülasyonlar yanı sıra üretim partiler arasında yapılır ve elde edilen değerleri arasındaki farklar termal stabilite ve yapısal konformasyonunda farklılık gösterir. Stabilite çalışmaları için bir endüstriyel ortamda DSC kullanımını gösteren yanı sıra önemli üretim aşamalarının izlenmesi Veriler bu pro etkinliği kanıtı olarak sunulmaktadırtokol. protein şeklindeki termal stabilitesini değerlendirmek için, diğer yöntemlere göre, DSC ve düşük maliyetli olan birkaç örnek hazırlama adımlarını gerektirir ve aynı zamanda protein açılma işleminin tam bir termodinamik bir profil sağlar.

Introduction

Diferansiyel tarama kalorimetrisi (DSC) ile doğrudan düzenlenmiş bir sıcaklık ^{^{^değişimi, 1,}} ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^{^5,} ^{^6,} ^{^7,} ^{^8,} ⁹ sırasında bir referans bir numunenin yer alan ısı enerjisi emme farkını ölçer deneysel bir yöntemdir ^, ^{^10,} ^{^11,} ^12. Bir diferansiyel tarama kalorimetresi Yürütülen ^yöntem, örnek bir hücre ve aynı zamanda ^{^2,} ¹³ üzerine her iki hücre sıcaklığının artırılması, aynı anda da, bir referans hücresi içine ısı enerjisi sokulması içerir14. , Numune ve referans bileşim içinde fark, farklı enerji miktarı hücreleri, ^{^2,} ^{^12,} ¹³ sıcaklığını yükseltmek için gerekli olacaktır. Bu durumda, hücreler arasındaki sıcaklık farkı telafi etmek için gerekli olan enerji, fazla miktarı ölçülür ve doğrudan örnek ^{^1,} ³ özel termodinamik özellikleri ile bağıntılandınlabilir.

1960'larda, MJ O'Neil ve Perkin Elmer E. Watson katı ^{^{^maddelerin, 2,}} ^{^3,} ^4, ısı akışını ölçmek için, ilk diferansiyel tarama kalorimetre geliştirdi. Buna paralel olarak, PL Privalov ve Fizik Enstitüsü, DR Monaseldze EL Gürcistan Cumhuriyeti (eski SSCB) fo kullanılabilecek eşsiz bir diferansiyel adyabatik kalorimetre yarattır biyokimyasal araştırmalar ^{^5,} ^6. Daha sonra, Gürcistan Fizik Enstitüsü, Cumhuriyet de Andronikashvili ekibi, bu tür DSC ^{^7,} ^{^8,} ⁹ kullanarak lifli ve küresel proteinler, DNA ve RNA gibi biyomoleküllerin ısı kapasitesi bildirdi. Sturtevant ^{^10,} ^{^11,} ^12, Brandts ¹³ ve Privalov ^{^14,} ^{^15,} ¹⁶ liderliğindeki birkaç takım protein açılımı termodinamik detaylarını araştırmak için teori ve DSC pratik uygulamaların geliştirilmesi üzerinde duruldu. Bu fajlar, kloroplast, fosfolipid, sıvı kristaller, ve et proteinler gibi büyük supramoleküler yapıları okuyan DSC değeri de ¹⁷ bildirilmiştir </ ^sup>, ^{^18,} ^{^19,} ^20.

DSC şimdi, biyomoleküllerin ısıl kararlılık değerlendirilmesi için özellikle proteinler ^{^1,} ^{^21,} ²² ilaç araştırma ve geliştirme alanında olağan hale gelmiştir. Bu deney ^{^23,} ²⁴ yürütmek için kullanılan aletlerin duyarlılığı ve otomasyon bakımından gelişmeler çoğunlukla kaynaklanmaktadır. Burada, DSC deney, sıcaklığın bir fonksiyonu olarak, yani molar ısı kapasitesi nihai sonucu, aşağıdaki termodinamik parametreleri tahmin etmek için kullanılır (ısı kapasitesi (ΔCp), entalpi (AH), entropi değişim (ΔS) denklemi aşağıda kullanarak ve Gibbs serbest enerjisi (ΔG)):

eq1.jpg "/> (1)

(2)

(3)

(4)

(5)

Nerede Cp ısı kapasitesi ölçülür; q test materyalinin içine ısı akışı olduğu; T ₀ ve T, sırasıyla ^{^22,} ²⁵ geçiş ilk ve son sıcaklık dereceleridir. Bu denklemler yukarıda iki devletli geçişi ve termal tersinir ²² açılımı tabi olabilir tek alan proteinler için de geçerli olduğunu fazlalaştı. Daha karmaşık proteinler (örneğin, olmayan iki devletli protein ve oligomerler) Analizi hFriere ve arkadaşları tarafından rapor edilmiştir ave. ^26; Johnson ve diğ. ^27; ve Kasimova ve diğ. ^28.

Bir protein, iki durum geçişini maruz veya termal denatürasyon sırasında ara maddeleri oluşturur olup olmadığını belirlemek için, deneysel olarak elde edilen entalpi (AH; ayrıca şu şekilde kalorimetrik entalpi Sh _Cal adlandırılır), aynı zamanda (aşağıda verilen van't Hoff denklemi kullanılarak elde edilen entalpi karşılaştırılır van't Hoff entalpi olarak anılacaktır; Sh _VH):

(6)

_Tm geçişin orta noktasını sıcaklığı, R, ideal gaz sabiti (1.987 kal ^mol-1 ^K-1) ve Y, katlanmamış durumda ^{^16,} ²⁹ protein nüfusun bölümüdür. EğerSh _VH Sh _Cal eşittir; veya Sh _VH / Sh _Cal 1'e eşit olduğu, daha sonra protein bir "ya hep ya hiç" geçiş (yani iki devletli geçiş) ^{^16,} ^{^25,} ²⁹ uğrar. Ancak, Sh _VH Sh _Cal az ise; veya Sh _VH / Sh _Cal protein olmayan bir iki devletli geçişi ^{^16,} ^{^25,} ²⁹ uğrar, daha az 1'dir. Sh _VH / Sh _Cal oranı da bir termodinamik kooperatif birimi veya etki alanı ²⁶ olarak erir protein yapısında oranına tekabül etmektedir.

ΔG ve Sh gibi yukarıda sözü edilen termodinamik parametreler biyolojik içeren proteinlerin termal stabilitesi hakkında yararlı bilgiler sağlar ^30. Bu protokol için bildirilen değerler Ancak, vurgu, bu yayındaki T _m ve Sh üzerine döşenecek. _Tm katlanmış protein kıvrımlanmamış dengede olan geçiş, (örneğin, ΔG = 0) ^{^25,} ³¹ orta noktası sıcaklığıdır. Termal stabilite ³¹ daha yüksek bir proteinin _Tm kadar yüksek olur. Sh (aynı zamanda termogramı olarak da bilinir) sıcaklık grafiğidir ısı kapasitesi tepe (ler) altında kalan alan karşılık gelen DSC deneyi ^{^16,} ²⁵ bir ucunda oluşturulan. Bu proteinleri denatüre etmek için ve bir protein formülasyondaki aktif fraksiyonu _(F) tahmin etmek için de kullanılabilir gerekli enerji (yani, bir numunedeki aktif yapının proteinlerin oranı), aşağıdaki denklem kullanılarak:

jove_content ">

(7)

Burada Sh protein örneğinin deneysel olarak türetilmiş entalpi ve Q da iyi karakterize edilmiş referans veya standart protein ²² için belirlenen entalpisini. F _a tahmini ICH ³² uyarınca stres koşullarında stabilite çalışmaları ürünlerin gerçek zamanlı istikrarı izleme yanı sıra yürütülmesi için önemlidir. Sh karşılaştırılması da bir protein ³¹ üçüncül yapı konformasyon kompakt hakkında bilgi sağlar.

Bu protokol, bir sanayi ortamında protein termal stabilitesini değerlendirmek için bir yöntem detayları ve yoğun aşı formülasyonunda kullanılmıştır. Tekrarlanabilir sonuçlar f üreten bir otomatik diferansiyel tarama kalorimetresi kullanılarak geliştirilmiştirya da 300 ug / mL gibi düşük bir protein konsantreleri.

Protocol

1. Enstrüman Başlangıç Diferansiyel tarama kalorimetresi açın ve numune kaynamasını engellemek için hücrelerde basıncı artırmak yanı sıra oluşturma yüksek sıcaklıklarda kabarcıklar engeller. Bu, tipik olarak sisteme azot tedarik ederek elde edilir. Hücre (örneğin, tantal, altın, platin, vs.) oluşturan malzemeye bağlı olarak, hücrenin zarar görmesini önlemek için üreticinin tavsiye basınca göre azot gazı besleme basıncını ayarlar. Örneğin, hücreye zarar verebilir 80 psi üzerinde bu prosedür geliştirmek için kullanılan cihaz için 45 psi'de azot gaz kaynağının basıncı ve basınç ayarlamak. Tüm temizlik maddesi depoları gerekli hacme kadar dolu olduğundan emin olun. gerekli temizleme maddeleri yıkama ve her bir örnek çalışmasından sonra, sırasıyla hücre temizlemek için deterjan ve su içerir. Numune tutma bölmenin sıcaklığı ayarlayınuygun bir değer, tercihen 5 ° C'ye kadar, deney öncesinde numunenin bütünlüğünü korumak için. 2. Numune Hazırlama deney için referans olarak kullanılacaktır tampona karşı örnek dialyze. Seçenek olarak ise, protein saflaştırma (örneğin, sütun elüsyon) son aşamasında toplanan elüsyon tamponu kullanılabilir. Bu Kjedahl yöntemi 33 veya Lowry yöntemi 34 gibi en uygun protein konsantrasyonu belirleme yöntemini kullanarak protein numune konsantrasyonunu belirlemek. Sonuçların objektif karşılaştırma için, aynı çalışma içinde tutarlı bir şekilde aynı yöntemi kullanın. Gerekli konsantrasyon aralığı enstrüman modeline bağlı olarak değişebilir. 1 mg / ml – Bu protokolde kullanılan enstrüman için tercih çalışma aralığı 0.5 olduğunu. vakum örnek ve referans tampon hacmi inaccur neden olabilir mikro kabarcık kurtulmak için DegasACY. Bu adım yeni kalorimetre modelleri için atlanabilir. Laminer akış biyolojik tecrit kabininde bir mikropipet ve steril ipuçları kullanılarak, alet ile uyumlu 96 oyuklu plakalara çift örnekleri ve bunların ilgili tampon yükleyin. Tampon-tamponu, sırasıyla su işlemi için su ile tampon ile kuyu ilk iki çift son iki çift doldurun. Tampon tampon taramaları ölçümü (enstrümantasyon hatası yani değerlendirmesini) örnek yanı sıra bir temel kurmak için önce aracın uygunluğunu teyit etmek; Su taramaları çalıştırmak ise hücreleri temizlemek için. bir sızdırmazlık film ile 96-plaka Kapak ve kuyular düzgün örnek kirlenmeyi önlemek için Biyogüvenlik Kurulu dışarı tabak almadan önce mühürlü olduğundan emin olun. Doğru yönde örnek tutan bölmeye plaka koyun. 3. Deneysel Parametre Ayarı Not: i bağlınstrumentation numuneler manuel bir şırınga kullanarak, ya da otomatik olarak, bir otomatik numune alıcı ile hücre içine yerleştirilebilir. Bu durumda, (örneğin, bir sanayi ortamında) olarak, bir otomatik numune zaman kazanmak için kullanılır. satın alma yazılımı kullanarak, plaka bölüm 2.4 uyarınca yüklenen sırayla örnek bilgileri giriniz. Varsa aksi halde, önceki veri analizi (bölüm 4.2) için analiz yazılımı içine konsantrasyon değerleri girin, konsantrasyonları girin. hücrelerde kalan hiçbir deterjan kalıntılarını sağlamak için birden fazla su ile durulama adımlarla takip edilmelidir her numune tarama, önce deterjanla hücrelerin temizlik sağlar seçeneği seçin. 20 ° C'ye kadar deney başlangıç sıcaklığına ayarlayın, ancak, bu örnek önceden bilgisine bağlı olarak değişebilir. daha düşük bir başlangıç sıcaklığı bilinmiyor örnekleri için uygulanabilir ise bilinen proteinleri için, önceden belirlenmiş bir başlangıç sıcaklığı kullanılabilir. Nihai sıcaklığı ayarlamakDeney, örneğin, 100 ° C'dir. Nihai sıcaklık, numunenin önceki bilgisine bağlı olarak değişebilir. Tipik tarama oranı deney tarama hızı, örneğin 60 ° C / h, ayarlayın. Ancak, tarama hızı, örneğin, numunenin önceki bilgisine bağlı olarak 90 ° C / h veya 120 ° C / h değişebilir. Açılım kinetiği değerlendirmek için farklı tarama hızlarında bilinmeyen örnekleri taramak için tavsiye edilir. Rescan numuneler açılımı termal geri dönüşlülüğünü araştırmak. İkinci tarama için elde edilen entalpi ilk tarama için entalpi değerinin en az% 80 olması durumunda bir proteinin açılımı geri dönüşümlü olarak kabul edilir. Kalorimetre hücrelerinin bütünlüğünü korumak için 10 ° C sonrası deney termostatı ayarlayın. Deney ayar parametreleri deney çalıştırmadan önce doğru olduğundan emin olun. Her şey yerinde ise, deney başlar. 4. Veri Analysis Denemeden ham veri alma ve analiz için bir defada bir örnek seçin. Örnek tarama Çıkar referans tarama, yani tampon. NOT: Referans çıkarma DSC araçların yeni modelleri ile otomatik olarak yürütülür. bu bölüm 3.1 uyarınca ihmal eğer örnek konsantrasyon değerini girin. Fit ve açılımı üzerine su hidrofobik grupların maruz kalma sonucu protein katlanmış ve katlanmamış devletlerin ısı kapasiteleri farklılıkları hesaba edinilen termogramı çizgisinin çıkarın. Doğrusal ya da kübik eğri örnek için DSC profili şekline bağlı olarak uygulanabilir. Tutarlılık için montaj aynı tip bir çalışma, örneğin gerçek zamanlı stabilite çalışması sırasında kullanılacak sahiptir. Bu adım, Tepe noktası entegrasyonu geçiş entalpisi elde etmek için eğri işlemek için gereklidir. lineer olmayan en küçük kareler kullanılarak Tepe noktası entegrasyonu gerçekleştirin. Ürünün göreBilgi iki devlet veya non-iki-devlet modelinin uygulayın. İki devlet modeli tek kooperatif termal geçişler için kullanılan ve daha fazla ürün bilgisi kullanılabilir duruma gelene kadar bilinmeyen proteinlerin olmayan iki devletli bir model uygulamak olabilir. Varsa, Ki-kare değeri sabit kalana kadar ekipmanın yazılımın mükerrer eğri işlevini kullanarak uydurma eğrisini ayarlamak. Elde edilen sonuçlar geçiş sıcaklıkları (Tm), kalorimetrik entalpisi (AH) ve numunenin van't Hoff entalpisi (AH VH) orta değerlerini gösterecektir.

Representative Results

Kalorimetre, aslında örnek çözeltisi içine ısı akışı hızındaki fark büyüklüğüne ve 35 tampon gibi en DSC deneyleri ham veriler, sıcaklık grafiğidir bir ısı akışı olarak gösterilmiştir. Her iki hücreler (yani örnek ve referans hücreleri) bir deney sırasında aynı çözümler içeriyor, bu nedenle, tarama ham veri gözlemlenebilir zirveleri ile düz bir çizgi olmalıdır. Gözlenen herhangi bir zirve neden örnek öncesinde analiz yeterli bir sistem uygunluk testi tampon taramaları çalışan enstrümantasyon hatası (örneğin hasarlı veya kontamine hücreler), isnat edilebilir. Şekil 1 kalorimetre analizi örnek öncesinde iyi çalışır durumda olduğunu belirten tipik bir tampon tarama sonucunu göstermektedir. Şekil 2, bir DSC deneyi için ham veriler fark ile gerçekleştirilen işlemleri göstermektedirİki protein örneklerinin erent çok. Daha önce ima gibi, gözlenen zirveleri örnekleri ve kendi tamponların ısı akışı farklılıklar vardır. Numune konsantrasyonu farklılıklar kalorimetre tarafından kaydedilen ısı kapasitesi değişikliklere sebep olabilir; Ancak, bu varyasyonlar prosedür bölüm 4.2 uygun olarak örnek analizi boyunca normalleştirilir. Daha yüksek konsantrasyonlar da düşük konsantrasyonlarda geçişe katkıda almayan ek termodinamik etki ortaya çıkarabilir. Buna ek olarak, her bir geçiş proteini 36 bir ya da daha fazla sayıda yapısal alanları içerebilir termodinamik alan temsil eder. Bu durumda, protein 1 işbirliği erime üzere üç yapısal alana sahiptir. Şekil 3 temel çıkarma ve mükerrer eğri fi sonra, yani Şekil 2'de, sunulan protein 1 ve 2 için ham verilerin analizinde elde edilen sonuçları göstermektedirtting. Ortaya çıkan termogramlar oranının taranması için normalize edilmiş ve konsantrasyon (otomatik olarak önceden ayarlanmış analiz yazılımı algoritması tarafından yürütülen); böylece, sıcaklık grafikleri karşı karşılaştırılabilir ısı kapasitesi deney sonuçlarını sunma. Analiz yazılımı açılımı proteinin işbirliğinden bağlı Yukarıda verilen denklemler varyasyonları kullanan diğer termodinamik parametreler elde etmek, bu tür T m ve ΔCp olarak sıcaklık grafikler, karşı ısı kapasitesi verileri kullanır. ayarı, bilinmeyen örnekler test ederken uygun sıcaklık aralığı önemlidir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, Aksi takdirde, tam olmayan termogramlar, neden olabilir. Bu profillerden Tm elde edilebilir olsa da, Sh doğru bir şekilde tespit edilemez. Bu nedenle, örnek tamamen ısı geçişi yakalamak için daha büyük bir sıcaklık aralığı ile yeniden test edilmesi gereklidir. Bazı proteinler de yenidenadily formu artan sonrası geçiş ısı kapasitesi sonuçlanan tam denatürasyon sonra agrega: Şekil 2B gösterildiği gibi bu genellikle eksik termogramı olarak görünür. Ancak, daha yüksek bir son sıcaklığı ile yeniden test var termogramın o bölgede bir yapısal geçiş bir olay ya da protein agrega sadece ısı emici etkisi olup olmadığını teyit yardımcı olabilir. Termal stabilite endüstrisinde 37 protein ve protein bazlı ürünlerin en önemli fiziksel özelliklerden biri olan. ilaç olarak, formülasyon tampon ve nem ve sıcaklık gibi çevresel faktörlerin de dahil olmak üzere, farklı koşullar altında biyolojik kararlılığını belirlemek için kullanılır. Aynı zamanda üretim partiler arasında yapısal tutarlılığı sağlamak için önemli üretim aşamasını (örneğin, arıtma ve detoksifikasyon) izlemek için kullanılır. <strong > 5 Şekiller ve 6 kararlılık ve iki farklı proteinin yapısal konformasyon sırasıyla kimyasal detoksifikasyon ve saklama koşulları etkisini incelemek için DSC kullanımını göstermektedir. Tm ve Sh önemli farklılıklar sırasıyla yapısal değişiklikler ve protein parçalanmasını gösterir. Buna ek olarak, Şekil 6 üçüncü geçiş kaybı, bundan başka (örnekler, çok açılı bir ışık saçılım (sek-MALS) ile boyut dışlama kromatografisi ile analiz edildiğinde molekül ağırlığında bir azalma ile doğrulandı bir etki nin degradasyonunu göstermektedir veri gösterilemiyor). Şekil 1: Tampon tarar. gözlemlenebilir zirveleri ile her tarama degrade benzerlik enstrüman iyi çalışır durumda olduğunu ve tekrarlanabilir sonuçlar oluşturduğunu gösterir.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2: DSC Deneyler toplanan ham veriler. Bu grafikler (yani önce bazal çıkarma ve eğri uydurma kadar) deneysel çalıştıktan sonra edinilen unanalyzed (ham) veri iyi temsilidir. Her satır bir üretim yeri temsil eder. Protein 2 termogramı sonrası geçiş bölgesinde, 100 ° C'nin üzerinde bir ısı kapasitesinde artış ile sonuçlanan, ısıtma üzerine hali hazırda daha araya eğilimindedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <br/> Şekil 3: DSC Veri Analiz. Bu grafikler (yani bazal çıkarma ve eğri uydurma sonra) analiz DSC verilerinin iyi temsilidir. Kırmızı çizgi termogramı için en uygun eğriyi temsil ederken mavi çizgi, bazal çıkarma sonra termogramı temsil eder. (A) Protein 1 Numune # 12 Tm ve Sh 80,16 ° C ve sırasıyla 1.69 x 10 6 cal / mol vardır. (B) Protein 1 Numune # 13 Tm ve Sh 80,15 ° C ve sırasıyla 1.71 x 10 6 cal / mol vardır. (C) Protein 2 Örnek # 21 Tm ve Sh 75.01 ° C ve sırasıyla 4.08 x 10 6 cal / mol vardır. (D) Protein 2 Örnek # 22 Tm ve Sh 75,67 ° C ve sırasıyla 4.22 x 10 6 cal / mol vardır. Için tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek. Şekil 4: Bir Eksik termogramını göstermektedir. Ham veri yetersiz sıcaklık aralığında analiz Protein 1 toplamak. Deneyin nihai sıcaklık 120 ° C olarak ayarlandı Şekil 2A için deney ile karşılaştırıldığında proteinin tüm geçiş profili uyum yoktu 90 ° C'ye ayarlandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 5: Veri protein 1. (A) proteini 1 tertier yapısı üzerinde kimyasal detoksifıkasyon etkisini gösteren Analiz hektar naif konformasyonuna ve bir toksin olduğu,2.57 x 10 5 cal / mol onun T 56.84 ° C'de m Sh s. (B) Protein 1 (yani toksoid) ve detoksifiye şekli sırasıyla T m ve 81,01 ° C Sh değerlerini ve 1.89 x 10 6 cal / mol vardır. Nedenle, detoksifikasyon adım, detoksifıye edilmiş formuna daha fazla istikrar (daha yüksek Tm) sağlayan proteini 1 yapısal konformasyona varyasyon şekli getirmiştir sonucuna varılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 6: Bu grafikler, depolama sıcaklığının etkisini göstermektedir veri Protein 3. konformasyon üzerinde saklama koşullarının etkisi gösteren Analiz (2-8 ° C) denge ve Pro tertier yapısına3 30 hafta boyunca tein. Tm ve 8. (A) Protein 3 ve depolama 38. haftada (B) Sh değerleri, aşağıdaki Tablo 1 'de verilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Numune Tm 1 (° C) Sh 1 (cal / mol) Tm 2 (° C) Sh 2 (cal / mol) Tm 3 (° C) Sh 3 (cal / mol) Protein, 3 8 hafta boyunca, 2-8 ° C'de saklandı 61.91 1.71 x 10 5 75,54 2.17 x 10 5 90,29 4.17 x 10 5 <td> Protein 3 38 hafta boyunca 2-8 ° C'de saklandı 61,87 1.66 x 10 5 75,18 1.46 x 10 5 90.22 5.76 x 10 5 Tablo 1: 2 de depolama 8. ve 38. Haftasında Protein 3 Tm ve Sh Değerler – 8 ° C. Her iki zaman noktasında Tm değerleri benzer olmakla birlikte, Sh değerlerindeki fark Protein 3 tertiyer yapısı ile belirlenen saklama koşulu altında 30 hafta boyunca düştüğünü göstermektedir.

Discussion

Bu prosedür başarıyla istikrar ve ürün karşılaştırma çalışmaları ²¹ dahil olmak üzere çeşitli karakterizasyon testi paketleri, dahil edilmiştir. Gerçek zamanlı stabilite çalışmalarda, DSC, raf ömrünü belirlemek için _Tm'ye izlemek, hem de zaman içinde biyolojik _{F, bir} tahmin etmek için kullanılır. Ürün karşılaştırılabilirlik açısından, süreç ve tesis değişikliğinin etkilerini yanı sıra üretilen birçok yapısal konformasyon anahtar üretim aşamalarının etkisini değerlendirmek için kullanılır. Bu genellikle ideal bir ürün olarak tayin edilmiştir referans ürüne üretilen partisinin Sh doğrudan karşılaştırılmasını gerektirir. Buna ek olarak, DSC ürün formülasyon çalışmaları ³⁷ için yararlı bir analitik araç olduğunu kanıtlamıştır. Farklı tamponlar ve farklı konsantrasyonlarda bir proteinin _Tm en kararlılık proffers formülasyonu tespit etmek için kullanılabilirProtein.

Bu yöntem ve sonuçlarının objektifliği güvenilirliğini sağlamak için, aynı çalışmada (örneğin, aşı formülasyonu çalışması) içinde çalıştırmak için çalışma tutarlı test parametrelerini tutmak önemlidir. Bununla birlikte, işlem çeşitli proteinlerin fiziksel özelliklerde farklılık uyum için değiştirilebilir. Yapılabilir bir modifikasyon örneği deney ^{^38,} ³⁹ tarama hızını değiştirmektedir. Daha hızlı bir tarama oranında incelenmiştir ısıtıldığında oluşturucu agrega eğilimli olan proteinler (örneğin, 120 ° C / saat) kalorimetre kılcal tıkanma gibi termik geçiş profilinin agrega katkı önlemek için. Bu oran tarayarak bir DSC deney ³⁸ sonucunu etkileyebilir dikkati çekiyor. Termal geçiş zirve genişletilmesi yanlısı bazı tarama oranlarının artırılması ile gözlenmiştirproteinlerinin; Ancak, _Tm oldukça sabit ³⁸ kalmıştır. Ayrıca, numune hazırlama için diyaliz ve gaz giderme adımları da doğru sonuçlar ³¹ için çok önemlidir. Diyaliz örnek ve tampon kompozisyonu tek fark protein sağlar; Bu şekilde, numune tarafından emilen tüm aşırı ısı proteinin ısı kapasitesi ile de ilişkilendirilebilir. Termodinamik parametre ekstrapolasyon açılımı olay sabit hacim ve basınç ³¹ altında oluştuğunu varsayar olarak gaz alma, hassas ses analizini sağlar. varsayım sabit basınç kısmı prosedürünün bölüm 1.1 uyarınca sisteme azot basınçlandırma ile muhasebeleştirilir.

Bu dairesel dikroizm (CD) Floresans Spektroskopileri olarak protein şeklindeki stabilitesini belirlemek için diğer yöntemler ile karşılaştırıldığında, DSC bir COM bir dizi avantaj sunarmaliyet ve zaman tasarrufu da dahil olmak üzere mercial ayarı. CD ve Floresans Spektroskopileri ⁶ enstrümantasyon ile ölçümlere göre Birincisi, bir diferansiyel taramalı kalorimetre adyabatik tasarımı daha iyi sıcaklık hassasiyetle termal stabilite ölçümü için izin verir. İkinci olarak, CD farklı olarak, DSC verilerin doğruluğu protein ^{^39,} ⁴⁰ arasında helisite bağlı değildir; Ancak, CD DSC ⁴¹ ücretsiz olacağını ikincil yapının açılımı hakkında ek bilgi sağlar. Buna ek olarak, DSC sistemin basınç örnek kaynatmadan geniş bir sıcaklık aralığı test sağlar; Bu yüzden, proteinlere geniş bir DSC ile test edilebilir.

DSC biyolojik termal stabilitesini belirlemek için, nispeten hızlı ve basit bir yaklaşım olsa da, sınırlama olmadan değildir. İlk olarak, noktahat çıkarma adımı ham veri analizi, insan tutarsızlık çeşit tanıttı; Böylece sonuçlar farklılıklar, farklı kullanıcılar arasında gözlemlenebilir. İkinci olarak, diferansiyel tarama kalorimetreleri toplu üretim ölçeğinde elde etmek zor olabilir asgari konsantrasyon sınırları var. geri dönüşümsüz termal denatürasyon Üçüncüsü, Sh mutlak değildir; ki içindeki senaryolarda türetilmiş ΔG (protein kararlılığının bir göstergesi) yanıltıcı anlamına gelmektedir. Bundan başka, yöntem, saflaştınlmış numuneler için yararlıdır. Herhangi bir etkileşim olup olmadığını İnceleme proteini veya yeni bir termal geçişler görünümü ile bir etkileşim olup olmadığını yabancı maddelerin varlığı _Tm bir değişikliğe neden olabilir ya da. Her durumda termogramları, bu ek özellikler yanlış böylece sonuçların yorumlanmasını etki, örnekler atfedilebilir. Bu kısıtlamalara rağmen, DSC th hakkında detaylı termodinamik bilgi verebilir güvenilir bir yöntem olmaya devamDüzgün ⁴² uygulanması halinde süreci açılımı e proteini.

Sonuç olarak, DSC aşı ürünler ve ara ürün için bir yapısal okuma aracı olarak önemli bir avantaj sunuyor. Aynı ürünün çok bir dizi için toplanan iki parametre, _Tm ve Sh, proses değişiklikleri, formülasyon, ve tersiyer yapının depolama koşulları ve protein stabilitesi etkisini incelemek için kullanılabilir ampirik taban çizgisi olabilir ve viral antijenler ^{^21,} ^43.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar tartışmalar için diferansiyel taramalı kalorimetre, Sasmit Deshmukh ve Webster Magcalas kurulum ve eğitim rollerinden ötürü (eski GE Healthcare ile), Joseph Mancini, Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments sınırlı) için müteşekkiriz.

Materials

Differential Scanning Calorimeter	Malvern Instruments Ltd	28428948 (Via GE Healthcare)	Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors.
Contrad 100	Decon Laboratories Inc	1504	Dilute with water to 20% before use
500µL Polypropylene round bottom 96 well plate	Canadian Life Science	ML072100	Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used
MicroCal ThermoVac	Malvern Instruments Ltd	N/Ap	provided with the Cap VP DSC
Biosafety cabinet	Labconco	Logic+ – A2	biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation
Slide-A-Lyzer dialysis cassette	Thermo Scientific	66810 or 66380	to equilibrate the sample and buffer

Riferimenti

Gill, P., Moghadam, T. T., Ranjbar, B. Differential scanning calorimetry techniques: applications in biology and nanoscience. J. Biomol. Tech. 21 (4), 167-193 (2010).
Watson, E. S., O’Neil, M. J. Differential microcalorimeter. Patent. , (1966).
O’Neill, M. J. The Analysis of a Temperature-Controlled Scanning Calorimeter. Anal. Chem. 36 (7), 1238-1245 (1964).
O’Neil, M. J. Measurement of Specific Heat Functions by Differential Scanning Calorimetry. Anal. Chem. 38 (10), 1331-1336 (1966).
Privalov, P. L., Monaselidze, D. R. . Mol. Biol. 6, 7-33 (1975).
Privalov, P. L., Plotnikov, V. V. Adiabatic differential microcalorimeter. Адиабатический дифференциальный микрокалориметр. , (1970).
Andronikashvili, E. L., et al. Calorimetric study of the nature of the intramolecular fusion of collagen, isolated from transplantable tumor. Dokl. Akad. Nauk. 183 (1), 212-214 (1968).
Andronikashvili, E. L., et al. . Conformational Changes of Biopolymers in Solution. , 171-173 (1973).
Andronikashvili, E. L. Malignant transformation and changes in various physic-chemical properties of macromolecules and supramolecular structures. Biofizika. 32 (5), 782-799 (1987).
Velicelebi, G., Sturtevant, J. M. Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol-water mixtures. Biochimica. 18 (7), 1180-1186 (1979).
Sturtevant, J. M. Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (6), 2236-2240 (1977).
Sturtevant, J. M. Biochemical applications of differential scanning calorimetry. Annu. Rev. of Phys. Chem. 38, 463-488 (1987).
Jackson, W. M., Brandts, J. F. Thermodynamics of protein denaturation. A calorimetric study of the reversible denaturation of chymotrypsinogen and conclusions regarding the accuracy of the two-state approximation. Biochem. 9 (11), 2294-2301 (1970).
Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N., Atanasov, B. P. Thermodynamic analysis of thermal transitions in globular proteins. I. Calorimetric study of chymotrypsinogen, ribonuclease and myoglobin. Biopolymers. 10 (10), 1865-1890 (1971).
Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N. A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study. J. Mol. Biol. 86 (3), 665-684 (1974).
Privalov, P. L., Potekhin, S. A. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. Methods Enzymol. 131, 4-51 (1986).
Veprintseva, O. D., Emelyanenko, V. I., Konstantinova, V. V., Shnyrov, V. L. The importance of structural changes in bacteriophage T4 tail proteins. Biofizika. 33, 954-961 (1988).
Shutilova, N., Semenova, G., Klimov, V., Shnyrov, V. Temperature-induced functional and structural transformations of the photosystem II oxygen-evolving complex in spinach subchloroplast preparations. Biochem. Mol. Biol. Int. 35 (6), 1233-1243 (1995).
Sanina, N. M., Kostetsky, E. Y. a., Shnyrov, V. L. Calorimetric investigation of phosphatidyl choline from membranes of marine invertebrates. J. Evol. Biokhim. Physiol. 23, 451-460 (1987).
Oreshkin, E. F., et al. Conformational changes in the muscle proteins of cured beef during heating. Meat Science. 16 (4), 297-305 (1986).
Kirkitadze, M., Hu, J., Tang, M., Carpick, B. Qualification of a differential scanning calorimetry method for biophysical characterization of monoclonal antibodies and protein vaccine antigens. Pharm. Bioprocess. 2 (6), 491-498 (2014).
Jiskoot, W., Daan, C. . Methods for structural analysis of protein pharmaceuticals. 3, (2005).
Plotnikov, V. V., Brandts, M., Lin, L. N., Brandts, J. F. A new ultrasensitive scanning calorimeter. Anal. Biochem. 250 (2), 237-244 (1997).
Plotnikov, V. V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev. Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
Freire, E. Differential scanning calorimetry. Protein Stability and Folding: Theory and Practice. Method in Molecular Biology. 40, 191-218 (1995).
Freire, E., van Osdol, W. W., Mayorga, O. L., Sanchez-Ruiz, J. M. Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 159-188 (1990).
Johnson, C. R., Morin, P. E., Arrowsmith, C. H., Freire, E. Thermodynamic analysis of the structural stability of the tetrameric oligomerization domain of p53 tumor suppressor. Biochimica. 34 (16), 5309-5316 (1995).
Kasimova, M. R., Sam, J. M., Freire, E. The conformational equilibrium of human growth hormone. J. Mol. Biol. 277 (2), 409-418 (1998).
Saboury, A. A., Moosavi-Movahedi, A. A. Clarification of calorimetric and van’t hoff enthalpies for evaluation of protein transition states. Biochem Edu. 22 (4), 210-211 (1994).
Privalov, P. L. Microcalorimetry of proteins and their complexes. Protein Structure, Stability, and Interactions. Method in Molecular Biology. 490, 1-39 (2009).
Dehghan-Nayeri, N., Rezaei-Tavirani, M. The Interpretation of Protein Structure Through Relationship of Melting Point (Tm) and Enthalpy of Unfolding (ΔHU). Int J Anal Pharma Biomed Sci. 4 (1), 47-50 (2015).
. Stability testing of new drug substances and products. Guideline, ICH Harmonised Tripartite. 1 (2), (2003).
Kjeldahl, J. Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen Körpern (New method for the determination of nitrogen in organic substances). Zeitschrift für analytische Chemie. 22 (1), 366-383 (1883).
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
HÖhne, G., Hemminger, W., Flammersheim, H. J. . Differential Scanning Calorimetry. , (2003).
Porter, L. L., George, D. R. A thermodynamic definition of protein domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (24), 9420-9425 (2012).
Frokjaer, S., Daniel, E. O. Protein drug stability: a formulation challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 298-306 (2005).
Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Arch. Biochem. Biophys. 531, 100-109 (2013).
Chiu, M. H., Elmar, J. P. Differential scanning calorimetry: an invaluable tool for a detailed thermodynamic characterization of macromolecules and their interactions. J. Pharm. Bioallied Sci. 3 (1), 39-59 (2011).
Hirst, J. D., Charles, L. B. Helicity, circular dichroism and molecular dynamics of proteins. J. Mol. Biol. 243 (2), 173-178 (1994).
Kirkitadze, M. D., et al. Central modules of the vaccinia virus complement control protein are not in extensive contact. Biochem. J. 344 (1), 167-175 (1999).
Freire, E., SchÖn, A., Hutchins, B. M., Brown, R. K. Chemical denaturation as a tool in the formulation optimization of biologics. Drug disc today. 18 (19), 1007-1013 (2013).
Wen, J., et al. Applications of differential scanning calorimetry for thermal stability analysis of proteins: qualification of DSC. J. Pharm. Sci. 101 (3), 955-964 (2012).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citazione di questo articolo

Durowoju, I. B., Bhandal, K. S., Hu, J., Carpick, B., Kirkitadze, M. Differential Scanning Calorimetry — A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen. J. Vis. Exp. (121), e55262, doi:10.3791/55262 (2017).