경유 곰팡이에 의한 신속한 결실 생산<em> 아그로 박테 리움</em> OSCAR 삭제 구성 요소의 중재 변환
Summary
상 동성 재조합을 통해 생성 된 유전자 결실 돌연변이는 유전자 기능 연구의 황금 표준이다. 결실 구조물의 신속한 생성을위한 OSCAR (Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids의 One Step Construction) 방법이 기술되어있다. 아그로 박테 리움 매개 곰팡이 형질 전환이 이어진다. 마지막으로, 곰팡이 형질 전환 체에서 PCR을 이용한 유전자 결실 확인 방법을 제시한다.
Abstract
게놈의 나머지 부분을 그대로두고 관심있는 유전자를 정확하게 삭제하면 살아있는 유기체에서 특정 유전자의 기능을 결정하는 이상적인 제품을 제공합니다. 이 프로토콜에서 정확하고 신속한 삭제 플라스미드 구성의 OSCAR 방법이 설명됩니다. OSCAR는 관심 유전자의 정제 PCR 증폭 5 '및 3'측면과 두 개의 플라스미드, pA-Hyg OSCAR (마커 벡터) 및 pOSCAR (조립체)를 포함하는 단일 재조합 효소 반응이 수행되는 클로닝 시스템에 의존한다 벡터). 올바르게 조립 된 결실 벡터의 확인은 제한 효소지도 작성과 시퀀싱에 의해 수행됩니다. Agrobacterium tumefaciens 는 곰팡이 포자 (ATMT)에 결실 구조의 도입을 매개하는데 사용된다. 마지막으로, PCR 분석은 상 동성 또는 비 상 동성 재조합에 의해 결실 된 결실 구조가 유전자 결실을 나타내는 지 또는이소성 통합. 이 접근법은 Verticillium dahliae 와 Fusarium verticillioides 에서 수많은 종의 유전자를 삭제하는데 성공적으로 사용되었습니다.
Introduction
유전 적 해부는 개인 또는 유전자 조합의 기능적 중요성을 결정하는 강력한 방법입니다. 특정 유전자의 역할을 이해하기위한 표준 접근법은 다른 유전자에서 변경되지 않은 단일 유전자 돌연변이의 생산이다. 가장 강력하고 최소한의 혼란을주는 접근법은 다른 유전자 기능에 손상을주지 않으면 서 관심 유전자의 오픈 리딩 프레임 (GOI ORF) 유전자를 완전하고 정확하게 삭제하는 것입니다.
삭제 플라스미드 생성을위한 표준 라이 게이션 접근법은 여러 단계가 필요하기 때문에 OSCAR 1 에 대한 합리적인 방법은보다 신속한 시험 관내 접근법을 생산하는 것이 었습니다. 그림 1 은 OSCAR 방식의 어셈블리 프로세스를 보여줍니다. 여기에 설명 된 방법은 이후의 Agrobacterium tumefaciens 매개 transfo와 결합하여 단일 multipart 반응에서 개별 유전자 삭제 벡터의 빠른 건설을 결합의 장점이 있습니다(ATMT). OSCAR는 매우 신속하며 효모 2 에서 Gibson assembly 사용과 같은 다른 전략과 잘 비교됩니다. OSCAR 방법은 여러 종류의 진균류와 함께 성공적으로 사용되었습니다. 이러한 종은 다음을 포함한다 : Fusarium verticillioides (미공개), Verticillium dahliae 3 , Setospaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 및 Dothistroma septosporum 9 및 Sarocladium zeae (미공개) .
이 프로토콜은 프라이머 디자인, 플랭크 PCR 증폭, OSCAR BP 반응, 결실 구조 구조 확인, 변형을 포함한 방법에 대한 단계별 지침을 제공합니다이온으로 구성 하고, 결실 구조를 곰팡이 세포로 ATMT에 옮기고, 최종적으로 균류 결실 돌연변이를 돌연변이 적으로 결실 된 결실 구조물과 차별화시킨다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Agrobacterium의 한 단계 건설 – 재조합 준비 – 플라스미드 (OSCAR)는 지속적으로 증가하는 자낭 균 (Ascomycota) 균류에 성공적으로 사용되었습니다. 이 방법은 Basidiomycota 및 Agrobacterium 매개 형질 전환 및 상동 재조합이 가능하다고 가정하고 다른 진균 성 phyla의 종 (선택 마커 유전자를 유도하는 적절한 프로모터와 함께)에도 쉽게 적용 할 수 있어야한다. 항 곰팡이 화합물의 선택을 다양 화하고 이중…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Fusarium verticillioiodes 에서 OSCAR 돌연변이 생성을위한 학부 및 고등학생에게 Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez , Ashli Crepsac, Jeff Delong, 크리스 킹, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (빅토리아) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum , 크리스 벤슨, 루니 스토크 스, 한나 이텔, 제인 헐스, 자시 모하메드, 제임스 로긴스, 켈리 러셀, 그레 니 샤 존스, 크리스틴 셰퍼, 마리암 함머디, 에이브 윌슨, 카트리나 바스 모어, 토니 하퍼, 카린 맥기, 모흐메 모민, Thi Ngoc Le와 Angel Pham.
Materials
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Sequence file manipulation | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5 % agar if for solid medium | ||
| Co-cultivation medium | ATMT transformation induction (Reference 12) | ||
| Aspergillus minimal medium with Hygromycin | Fungal transformant selection | ||
| PDA medium | Acumedia | 7149A | Single spore slant tubes |
| PDA-Hyg-Kan medium | Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/ml hygromycin B and 100 μg/ml Kanamycin; | ||
| Glass beads | Genlantis | C400100 | Plate spreading |
| Nitrocellulose filters (47mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-culturing for ATMT |
| Various centifuge tubes | multiple preps | ||
| Petri plates (various) | Culturing of bacteria and Fungi | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Selectable marker vector |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Assembly vector |
| DH5a One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reaction transformation |
| ccdB survival E. coli cells | Life Technologies | A10460 | Maintenance of pOSCAR |
| Wooden transfer sticks | Colony streaking | ||
| Toothpicks | Colony picking | ||
| Microcentrifuge | Pelleting Bacteria etc | ||
| Preparative centrifuge | Fungal spore collection | ||
| Dissecting microscope | Single spore isolation | ||
| Automated Cell Counter | Spore suspension calculation | ||
| Compound microscope | Hemocytometer cell counting | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purification |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation |
| Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxim | TCI America | C2224 | |
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post staining agarose gels |
| Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Used to assemble deletion construct in pOSAR |
| PrimerQuest tool | IDT | Used in step 1.4; available on http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
Riferimenti
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