Rapid Deletion Produktion in Pilzen über<em> Agrobacterium</em> Vermittelte Transformation von OSCAR Deletion Constructs
Summary
Gen-Deletionsmutanten, die durch homologe Rekombination erzeugt werden, sind der Goldstandard für Genfunktionsstudien. Die OSCAR-Methode (Ein-Schritt-Konstruktion von Agrobacterium-Recombination-ready-Plasmiden) zur schnellen Erzeugung von Deletionskonstrukten wird beschrieben. Agrobacterium vermittelte Pilz-Transformation folgt. Schließlich wird eine PCR-basierte Bestätigungsmethode für Gendeletionen in Pilz-Transformanten vorgestellt.
Abstract
Präzise Deletion von Gen (s) von Interesse, während der Rest des Genoms unverändert, bietet das ideale Produkt, um die bestimmte Gen-Funktion im lebenden Organismus zu bestimmen. In diesem Protokoll wird das OSCAR-Verfahren der präzisen und schnellen Deletions-Plasmid-Konstruktion beschrieben. OSCAR beruht auf dem Klonierungssystem, in dem eine einzelne Rekombinase-Reaktion durchgeführt wird, die die gereinigten PCR-amplifizierten 5'- und 3'-Flanken des Gens von Interesse enthält, und zwei Plasmide, pA-Hyg OSCAR (der Markervektor) und POSCAR (die Assembly Vektor). Die Bestätigung des korrekt zusammengebauten Löschungsvektors wird durch eine Restriktionsverdauungsabbildung durchgeführt, gefolgt von einer Sequenzierung. Agrobacterium tumefaciens wird dann verwendet , um die Einführung des Deletionskonstrukts in Pilzsporen (bezeichnet als ATMT) zu vermitteln. Schließlich wird ein PCR-Assay beschrieben, um zu bestimmen, ob das Deletionskonstrukt durch homologe oder nicht-homologe Rekombination integriert ist, was eine Gendeletion oderEktopische Integration. Dieser Ansatz wurde erfolgreich für die Deletion von zahlreichen Genen in Verticillium Dahlien und in Fusarium verticillioides unter anderen Arten verwendet .
Introduction
Genetische Dissektion ist eine leistungsfähige Methode zur Bestimmung der funktionellen Bedeutung von Individuen oder Kombinationen von Genen. Ein Standardansatz, um die Rolle der spezifischen Gene zu verstehen, ist die Produktion von einzelnen Genmutanten, die in jedem anderen Gen unverändert sind. Der mächtigste und am wenigsten potenziell verwirrende Ansatz ist die vollständige und genaue Deletion eines offenen Leserahmens des Gen von Interesse (GOI ORF) ohne Schaden für jede andere Genfunktion.
Da Standard-Ligation Ansätze für die Deletion Plasmid-Generation erfordern mehrere Schritte, die rational für OSCAR 1 war, um eine schnellere in vitro Ansatz zu produzieren. Abbildung 1 zeigt den Montageprozess im OSCAR-Ansatz. Das hier beschriebene Verfahren hat den Vorteil, die schnelle Konstruktion einzelner Gendeletion-Vektoren in einer einzigen multipart-Reaktion in Kombination mit nachfolgendem Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Transfo zu kombinierenRmation (ATMT). OSCAR ist sehr schnell und vergleicht sich gut mit anderen Strategien wie die Verwendung von Gibson Montage in Hefe 2 . Die OSCAR-Methode wurde erfolgreich mit mehreren Ascomycota-Arten von Pilzen verwendet. Zu diesen Arten gehören: Fusarium verticillioides (unveröffentlicht), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 und Dothistroma septosporum 9 und Sarocladium zeae (unveröffentlicht) .
Dieses Protokoll liefert eine Schritt-für-Schritt-Anweisung für das Verfahren einschließlich des Primerentwurfs, der Flanken-PCR-Amplifikation, der OSCAR-BP-Reaktion, der Deletionskonstruktstruktur-Bestätigung, der TransformationIon von Agrobacterium mit dem Konstrukt, gefolgt von einer ATMT-basierten Übertragung des Deletionskonstrukts in die Pilzzellen, und schließlich die Differenzierung von Pilz-Deletionsmutanten von denen mit ektopisch integrierten Deletionskonstrukten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein Schritt Aufbau von Agrobacterium -Recombination-ready-Plasmiden (OSCAR) wurde erfolgreich mit einer ständig wachsenden Anzahl von Ascomycota Pilzen eingesetzt. Die Methode sollte auch leicht auf die Basidiomycota und Spezies von anderen Pilzphyla (mit geeigneten Promotoren, die selektierbare Markergene treiben) anwenden, wobei angenommen wird, dass Agrobacterium vermittelte Transformation und homologe Rekombination möglich sind. Zusätzliche Markervektoren wurden erzeugt, um die Auswahl …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den folgenden Studenten und Gymnasiasten für ihre Arbeit, um OSCAR-Mutanten in Fusarium verticillioiodes zu generieren : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez , Ashli Crepsac, Jeff Delong, Christlicher König, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Koch, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le und Angel Pham.
Materials
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Sequence file manipulation | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5 % agar if for solid medium | ||
| Co-cultivation medium | ATMT transformation induction (Reference 12) | ||
| Aspergillus minimal medium with Hygromycin | Fungal transformant selection | ||
| PDA medium | Acumedia | 7149A | Single spore slant tubes |
| PDA-Hyg-Kan medium | Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/ml hygromycin B and 100 μg/ml Kanamycin; | ||
| Glass beads | Genlantis | C400100 | Plate spreading |
| Nitrocellulose filters (47mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-culturing for ATMT |
| Various centifuge tubes | multiple preps | ||
| Petri plates (various) | Culturing of bacteria and Fungi | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Selectable marker vector |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Assembly vector |
| DH5a One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reaction transformation |
| ccdB survival E. coli cells | Life Technologies | A10460 | Maintenance of pOSCAR |
| Wooden transfer sticks | Colony streaking | ||
| Toothpicks | Colony picking | ||
| Microcentrifuge | Pelleting Bacteria etc | ||
| Preparative centrifuge | Fungal spore collection | ||
| Dissecting microscope | Single spore isolation | ||
| Automated Cell Counter | Spore suspension calculation | ||
| Compound microscope | Hemocytometer cell counting | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purification |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation |
| Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxim | TCI America | C2224 | |
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post staining agarose gels |
| Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Used to assemble deletion construct in pOSAR |
| PrimerQuest tool | IDT | Used in step 1.4; available on http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
Riferimenti
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