Tonina Delfín (Tursiops truncatus) espermatozoides: recolección, criopreservación y fecundación In Vitro heteróloga
Summary
Aquí, presentamos los protocolos que se han utilizado con éxito para delfín espermatozoides recolección, criopreservación y rendimiento de fecundación in vitro heteróloga utilizando ovocitos bovinos.
Abstract
El uso de espermatozoides criopreservados delfín facilita el intercambio de material genético entre parques acuáticos y hace accesible a los laboratorios de estudios para mejorar nuestra comprensión de la reproducción de mamíferos marinos espermatozoides. Fecundación in vitro heteróloga, un reemplazo para la FIV homóloga, podría proporcionar un medio para probar la fertilidad de esperma potencial; para estudiar la fisiología de gametos y desarrollo temprano del embrión; y evitar el uso de ovocitos de valioso delfín, que son difíciles de obtener. Aquí, presentamos los protocolos que se han utilizado con éxito para recoger y criopreservar espermatozoides de delfín. La colección de semen se realiza por estimulación manual de delfines entrenados. Criopreservación se logra utilizando un extensor TRIS base de yema de huevo con el glicerol. Además, presentamos un protocolo que describe FIV heteróloga utilizando delfines espermatozoides y ovocitos bovinos y que verifica la naturaleza híbrida del embrión resultante mediante PCR. Fecundación heteróloga plantea preguntas sobre fertilización y puede utilizarse como una herramienta para estudiar la fisiología de gametos y desarrollo temprano del embrión. Además, el éxito de la FIV heteróloga demuestra el potencial de esta técnica para probar la capacidad, lo que vale la pena la examinación adicional de la fertilización de espermatozoides delfín.
Introduction
Tecnologías de reproducción asistida están poco desarrollados en los animales salvajes, incluyendo los mamíferos marinos. La falta de métodos sensibles para evaluar éxito fecundante de espermatozoides contribuye al lento desarrollo de tecnologías reproductivas en especies como los delfines. No fue hasta recientemente que los parámetros seminales básicos del delfín mular (Tursiops truncatus) fueron reportados1,2. Sin embargo, las variables tales como la motilidad y morfología, aunque ampliamente utilizado, dan información limitada sobre la eficiencia reproductiva. El mejor indicador de la calidad del esperma es la evaluación del potencial fecundante.
Recientemente, nuestro grupo utiliza un método para evaluar semen delfín potencial de la fertilización mediante la evaluación de formación pronuclear masculina o la formación de embriones híbridos después de la fecundación in vitro heteróloga con zona intacta ovocitos bovinos3. El uso de FIV heteróloga delfín bovino tiene ventajas importantes sobre fecundación in vitro homóloga, como supera la dificultad de obtener ovocitos de delfín y facilita el uso de bien probado en vitro sistemas de maduración de ovocitos bovinos. Para evitar la especificidad de especie, fecundación heteróloga se realiza generalmente en la ausencia de ZP. Aunque se permite para la evaluación de la capacidad de los espermatozoides con acrosoma reaccionado se fusionan con la membrana vitelina, deteriora la evaluación de otras características relacionadas con la fertilización. El procedimiento descrito utiliza ovocitos intactos de la zona y permite la evaluación de los siguientes parámetros: enlace zona de esperma y fijación, penetración, polyspermy, formación pronuclear y escote de embrión híbrido.
Aquí, presentamos varios protocolos de recogida de esperma, espermograma básico, congelación de espermatozoides, así como la evaluación de la funcionalidad del esperma de delfines mediante la evaluación de la formación de embrión pronuclear o híbrido macho después de la fecundación in vitro heteróloga con zona intacta ovocitos bovinos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para muchas especies mamíferas diferentes, hay diversas ventajas al uso de semen congelado. Estos incluyen la capacidad de transferir material genético valioso, el potencial de distribución en todo el mundo, el bajo riesgo de contaminación y la capacidad de preservar gametos masculinos durante décadas. El uso de espermatozoides criopreservados es esencial para el delfín mular, porque esta especie está protegida en el Apéndice II de CITES, que limita el transporte y el intercambio de animales entre diferentes parq…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
su trabajo fue financiado por el Ministerio de economía y competitividad (70140-AGL2015-R a D. Rizos), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan y J. F. Pérez-Gutiérrez y la Fundación Séneca de Murcia (Grant 20040/germen/16 a F. García Vázquez)
Materials
| FERT-TALP medium | Merck | |
| TCM-199 | Sigma | M-4530 |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| Taq polymerase | Promega | |
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | |
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | |
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | |
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | |
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | |
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | |
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | |
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | |
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | |
| Microcentrifuge tubes | VWR | |
| UV iluminator | Bio-Rad | |
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
Riferimenti
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
- Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
- Robeck, T. R., O’brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
- Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
- Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
- Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
- Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).
