التلاعب وظيفي من الأم جين المنتجات التي تستخدم<em> في المختبر</em> نضوج البويضة في الزرد
Summary
ويرد بروتوكول الأمثل لنضوج البويضات في المختبر من الزرد تستخدم للتلاعب من المنتجات الجينات الأمهات هنا.
Abstract
هي التي تحرك الأحداث الخلوية التي تحدث أثناء المراحل الأولى من التطور الجنيني الحيوانية من المنتجات الجينات المستمدة أمهات المودعة في البويضة النامية. لأن هذه الأحداث تعتمد على المنتجات الأمهات التي تعمل عادة في وقت قريب جدا بعد الإخصاب التي preexist داخل البيضة، نهجا موحدة للتعبير والحد من ظيفية تنطوي على حقن الكواشف داخل البويضة المخصبة غير فعالة عادة. بدلا من ذلك، يجب إجراء هذه المناورات خلال مراحل تكوين البويضات، قبل أو أثناء تراكم المنتجات الأمهات. توضح هذه المقالة بالتفصيل بروتوكول لنضوج البويضات في المختبر من الزرد غير ناضجة والتسميد في وقت لاحق في المختبر، مما أسفر عن أجنة قابلة للحياة التي تعيش إلى سن البلوغ. هذا الأسلوب يسمح للتلاعب وظيفي للمنتجات الأمهات أثناء مراحل تكوين البويضات، مثل التعبير من المنتجات لإنقاذ المظهرية والمعلمة والتصور بناء، وكذلك لق الحد من وظيفة الجين من خلال وكلاء عكس علم الوراثة.
Introduction
خلال تنمية الحيوانية، والودائع الأم منتجات الجين (على سبيل المثال، الرنا والبروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى) داخل البويضة. هذه المنتجات هي مهمة للعمليات الخلوية الأولى مباشرة بعد الإخصاب 1 و 2. التلاعب في التعبير وظيفة من المنتجات الأمهات عادة غير فعالة عند استخدام نهج موحد لحقن الكواشف في بويضات المخصبة 3. وذلك لأن يتم إنتاج معظم الرنا والبروتينات التي البويضة خلال مراحل تكوين البويضات، من المنتجات للأمهات قبل تحميلها موجودة في بويضة ناضجة بالفعل. هذه المنتجات الموجودة مسبقا هي منيع لضربة قاضية وظيفية مع الجينات التي تستهدف وكلاء، مثل oligos Morpholino العقاقير (موس)، لأن المنظمات الأعضاء استهداف مرنا، وليس البروتين موجودة مسبقا موجودة بالفعل في البيضة عند التلقيح. وبالإضافة إلى ذلك، تحدث العديد من العمليات الجنيني المبكر في وقت قريب جدا بعد الإخصاب إلى أن influenدائرة الهندسة المدنية من منتجات البروتين مشتقة من RNA حقنها في البويضة المخصبة، كما RNA قد لا يتم إنتاجها بسرعة كافية للتأثير على الأحداث الأولى من التطور الجنيني. لنفس السبب، الموسومة اندماج بروتين وأعرب عن طريق حقن مرنا في البويضة المخصبة قد لا يتم إنتاجها في الوقت المناسب لالتصور خلال دورها الفاعل في الجنين في وقت مبكر. حقن البويضات الناضجة مقذوف قبل تفعيل البيض ممكن ولكنه يترافق مع القضايا الفنية مماثلة: بالفعل هذه البيض نضجا محملة مسبقا مع البروتين الأمهات، وأنها لن تصبح نشطة translationally (أي إنتاج بروتين من محاضر الخارجية) حتى بعد البيض التنشيط. لهذه الأسباب، والتلاعب في المنتجات الجين الأم تعمل في مرحلة التطور الجنيني المبكر يحتاج عادة إلى القيام بها أثناء مراحل تكوين البويضات في البويضة تنضج.
مع اقتراب موعد واحد للتغلب على هذه العقبات، في أساليب نضوج في المختبر، والتي تسمح للنضوج شركة النفط العمانيةytes من المرحلة الرابعة لتشكيل البيض، وقد تم تأسيسها في الزرد. طرق مبكرة سمحت في نضوج في المختبر، ولكن كانت البيض نضجا مما أدى يست مختصة للإخصاب 4. وفي وقت لاحق، والتلاعب في ظروف التربية من محايدة إلى درجة الحموضة 9.0، محاكاة درجة الحموضة القلوية من السائل المبيض وجدت في أنواع الأسماك 5، 6، سمح لموثوق التخصيب في المختبر (IVF) في المختبر بعد نضوج 7 و 8. في الواقع، يمكن في المختبر البويضات -matured تسفر الأجنة قابلة للحياة التي تعيش إلى مرحلة البلوغ والتي هي خصبة 3 و 8. وقد تم تكييف هذه الطريقة تحسن أبعد لتشمل التلاعب الوظيفي للجينات الأم، والتعبير عن البروتينات الموسومة خلال مراحل تكوين البويضات الزرد من خلال التعبير خارجي، وMO بوساطة ظيفية نهدم في حصيرةمرحلة أورينغ IV البويضات 3 (الشكل 1).
مراحل تكوين البويضات الزرد يعرض عدد من المراحل المميزة التي أدت إلى تشكيل البويضات الناضجة 9 (انظر الجدول رقم 1 لدليل سريع إلى مراحل مختلفة في مراحل تكوين البويضات). لفترة وجيزة، وبدأ تطور البويضة بواسطة البويضات المرحلة الأولى ويتم إلقاء القبض عليه في مرحلة طور التضعف من الطور الأول من الانقسام الاختزالي. هذه البويضات تخضع النمو من خلال النسخ النشط (بدأت خلال مراحل IA وIB)، وتشكيل الحويصلات القشرية (المعروف أيضا باسم حبيبات القشرية، التي بدأت خلال المرحلة الثانية)، وتكون المح (بدأت خلال المرحلة الثالثة). اكتمال نمو البويضة خلال المرحلة الرابعة، عندما الانقسام الاختزالي يستأنف الأول، مما أدى إلى تفكك نواة بويضة، ويشار إلى الحويصلة الجرثومية (GV). وفي وقت لاحق، تم إلقاء القبض الانقسام الاختزالي مرة أخرى في الطورية II. الانتهاء من نمو البويضة واعتقال الانتصافي خلال المرحلة الرابعة يؤدي إلى مرحلة ناضجة V على سبيل المثالز 9. تحدث إزالة غشاء مسامي خلال الافراج عن البويضة في تجويف المبيض 10 و ضرورية للإخصاب وتفعيل البيض السليم. مرة واحدة تنبثق البيض من الأم أثناء التزاوج الطبيعي، فإنها تصبح تفعيلها. في الزرد، والتعرض للمياه كافية لتفعيل البيض الكامل، بغض النظر عن وجود الحيوانات المنوية 11.
في ظروف المختبر يسمح حاليا للنضوج البويضات من المرحلة المبكرة IV-التي يمكن التعرف عليه بواسطة حجمها (690-730 ميكرون)، وجود GV كبير في وضع غير المتماثلة، ومظهر معتم تماما بسبب تراكم بروتينات صفار (الشكل 2B) -to ناضجة مرحلة V البيض، وتتميز GV تفكيكها تماما ومظهر شفاف المقرر أن صفار معالجة بروتين 12 (الشكل 2C). في هذا النهج، المبايض كلها تابعتتم إزالة aining البويضات في مراحل مختلفة من التنمية من الإناث. يسمح البويضات لتطوير في 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-واحد (DHP)، فعال يحفز نضوج هرمون 8. خلال هذه الفترة، البويضات النضج يمكن التلاعب بها من خلال حقن التعبير (على سبيل المثال، توج، في المختبر -transcribed من mRNAs) أو عكس علم الوراثة وكلاء (على سبيل المثال، موس). طبقة الجريبي لا يلقي عفويا في نهاية فترة النضج، لذلك يجب إزالتها يدويا. بعد defolliculation، ويتحقق التخصيب في المختبر عن طريق إحداث تنشيط البويضة من خلال التعرض للالبيض في الماء (موجودا في الجنين المتوسطة (E3)) 13، وإيجاد حل الحيوانات المنوية. وبيضات ملقحة الناتجة تخضع التطور الجنيني وتسمح لتقييم قدرة العلاجات التلاعب وظيفة الجين الأم ولتصور وتحليل المنتجات الأمهات الموسومة ( <strong> الشكل 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول أعلاه هو للتلاعب من المنتجات الجينات قبل الإخصاب، وبالتالي السماح لدراسة الجينات المنتجات الأمهات في الجنين الزرد في وقت مبكر. وكانت دراسات سابقة قادرة على تنضج البويضات في المختبر (4)؛ تم تعديل هذا البروتوكول للسماح للإخصاب في المختبر لاحق نضجت البويضات 8. وهذا بدوره يسمح لحقن المواد الكيميائية للتلاعب وظيفي والتصور من المنتجات ورثت أمومي في أوائل الجنين 3. الأجنة الناتجة عن هذه الطريقة يمكن أن تكون قابلة للحياة ويمكن البقاء على قيد الحياة ليصبحوا بالغين خصبة. في التجارب الأولية، كان ما يقرب من نصف الأجنة المخصبة المستمدة من هذا الإجراء قابلا للتطبيق في يوم 5 من التنمية، وفقا لتقييم التضخم المثانة السباحة في تلك المرحلة، نصفها تقريبا أصبح صحية، خصبة البالغين (الملاحظات غير منشورة).
هناك عددخطوات حاسمة للنظر في البروتوكول. البويضات في المرحلة المناسبة لبدء النضج (أوائل المرحلة الرابعة) يمكن التخصيب إذا تم تزاوج الأنثى في الآونة الأخيرة، ولكن ليس قبل 8 النيابة العامة. استخدام الأسماك التي لم تزاوج مؤخرا قد يؤدي إلى تحولها البيض 14، والتي لن تخضع النضج. سوف الإناث تزاوج خلال أقل من 8 أيام لديهم أغلبية من البيض في المرحلة الثالثة أو أقل، وبالتالي، فإن البيض لا تنضج بشكل صحيح في المختبر. والمبايض في الإناث التي تزاوج قبل 8 أيام يكون لها جزء الأمثل للالبويضات في مرحلة مبكرة IV. ويمكن التعرف على هذه عن طريق التعتيم على وجود GV في موقف غريب الأطوار (الشكل 2B). ويمكن أيضا أن بويضة تقرير المرحلة يتم بمساعدة من قياس حجم، مع البويضات وضعت على شريحة ميكرون تخرج تحت المجهر ومقارنة مع المبادئ التوجيهية انطلاق القياسية (الجدول 1). ومع ذلك، البويضات IV مرحلة مبكرة لها حجم شبه القصوى مقارنة حتى تنضجالبويضات (معترف بها من قبل الشفافية النسبية وعدم وجود GV، الشكل 2C) ويتم التعرف بسهولة، كما هو موضح أعلاه، الذي سيغني عموما الحاجة إلى القياس المباشر حجم البويضة.
في نضوج المختبر يجب أن تبدأ في غضون عدة ساعات من نهاية دورة النهار التي يتم تأقلم المانحين بويضة الأنثى. والبويضات لا تنضج بشكل صحيح، ينعكس في معدلات التسميد الفقيرة، إذا مثقف خلال الفترة الصباحية من دورة الخفيفة. لا يفهم سبب تبعية الساعة البيولوجية للفي المختبر بويضة طريقة النضج ولكن من المرجح يعكس التحيز الساعة البيولوجية الكامنة في الجسم الحي في البيض النضج التي تنطوي على التعبير الجيني ركوب الدراجات أثناء مراحل تكوين البويضات 21. سبب شائع للالبويضات عدم الخضوع ناجحة في نضوج المختبر على الرغم من انطلاق البويضة الصحيح هو أن DHP قد انتهت. تنتهي DHP الهرمون بشكل عام بعد عام، ولضمان تأثيرنضوج إيف، يجب أن يتم استبدال الدفعة عمل في غضون 9 أشهر من الاستخدام.
حقن البويضات هو خطوة حاسمة أخرى عندما يكون الغرض من هذه الطريقة للتلاعب وظيفي للمنتجات الأمهات. هذا الإجراء ومتطلبات تختلف عن تلك التي لحقن القياسية في البويضة المخصبة في 0-30 MPF. وهناك عامل أساسي في حقن بويضة هو الحاجة إلى إجراء الحقن في ظل الظروف التي لا تؤدي إلى تنشيط البويضة سابقا لأوانه، كما هو الحال في ليبوفيتش L-15 متوسطة 22 و 23. لأنها هي جزء لا يتجزأ في المبايض، البويضات التي تستحق أيضا تحديات خاصة للحقن. بروتوكول فوق يوحي أولا النأي البويضات من المبايض ومن ثم عقد كل فصل على حدة بويضة مع ملقط في حين حقن. وقد عملت هذه التقنية بشكل جيد ويسمح البويضات الفرز قبل في المرحلة المناسبة مع الحد الأدنى من التعامل معها. ويمكن أيضا طرق بديلة يمكن استخدامها، مثلعلى النحو التالي: أ) وضع البويضات في حقن القياسية أحواض الاغاروز 15، حيث الجدران الرأسية للدعم حوض البويضة خلال حقن (في هذه الطريقة البديلة، تحتاج البويضات على أن يتم تحويلها إلى لوحات حقن حين يوضع في في المختبر نضوج المتوسطة) والثاني ) مما يسمح للبقاء البويضات التي تعلق على كتلة المبيض، والتي يمكن أن تعقد مع ملقط خلال الحقن لتجنب الاتصال مع البويضة حقن (في هذا النهج، ينبغي فصل البويضات بعد الحقن لكلا تسهيل التعرض DHP والسماح defolliculation بهم ، في حد ذاته ضروري لIVF). وعلى الرغم من هذا التحدي معين، البويضات IV مرحلة يمكن اختراقها بسهولة مع إبرة الحقن، على الأرجح لأن الغشاء المشيمي في هذه المرحلة ليست متطورة تماما 9.
واحد الحد من بروتوكول نضوج الحالي هو أنه في ظروف نضوج المختبر التي تعزز التنمية بويضة سليمةلا يمكن إنشاء عند بدء نضوج البويضة في مراحل مبكرة من المرحلة الرابعة. تصبح البويضات المختصة للرد على DHP التي تمر النضج عند بلوغهم يبلغ قطرها 520 ميكرون، والذي يحدث خلال المرحلة الثالثة (تكون المح الموافق مدى 340 إلى 690 ميكرون) 9. ومع ذلك، فإن ثقافة المرحلة الثالثة البويضات النتائج في البويضات التي ليست مختصة للإخصاب 3. البويضات فقط الذي يبدأ في المرحلة الرابعة (الشكل 2B) في المختبر الثقافة يمكن أن تتطور إلى ناضجة، البويضات مرحلة V (الشكل 2C وD). قد تكون متعلقة هذا إلى حقيقة أن المرحلة الثالثة هي ضرورية لتكون المح وبويضة نمو 9. وهكذا، في المختبر إجراء بويضة نضوج الواردة في هذه المادة ينبغي أن تستخدم فقط مع بدء سكان المرحلة الرابعة البويضات (B)، وليس مع البويضات في مراحل سابقة (مراحل I – III، شملت رقم البريد <strأونج> 2A). لنفس السبب، وهذا الإجراء يقتصر على الجينات التي يتم التعبير عنها في المرحلة الرابعة أو في وقت لاحق. قد يكون تلاعب وظيفي من الجينات التي يتم التعبير عنها في وقت سابق من المنتجات بدلا من الاعتماد على الأساليب الوراثية (انظر أدناه). قد تحسينات على الطرق في المختبر ثقافة النضج في المستقبل تسمح للبدء في زراعة بويضة في المراحل السابقة، وبالتالي توسيع قوة في المختبر نهج النضج.
قيود أخرى في طريقة عرض هو أن defolliculation، وهو أمر ضروري للخطوات اللاحقة التي الإخصاب، ويعمل حاليا الحد من معدل خطوة في الإجراء. غشاء مسامي هو عبارة عن طبقة شفافة المحيطة البويضة النامية، وإزالة يمكن أن تكون مملة. إذا لم تتم إزالة هذا الغشاء تماما، فإن البيض لا تصبح تفعيلها بشكل كامل والمخصبة. يرصد هذا واضح من فشل المشيمه لتوسيع وتطوير وضعها بشكل غير منتظم، ثلم مثل شارعructures (pseudocleavages)، سمة من أجنة غير مخصبة 11. طرق defolliculation الأنزيمية مثل كولاجيناز، كما تستخدم في القيطم، قد حوكموا. ومع ذلك، في أيدينا، لم يكن هذا الأسلوب ناجح، وبالتالي فإننا نعتمد على defolliculation اليدوي. لأن defolliculation اليدوي كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا، فمن الصعب الحصول على دفعات كبيرة من البويضات المخصبة بعد في المختبر بويضة النضج. بسبب القيد الزمني الذي تفرضه defolliculation اليدوي، نحن تسميد حاليا عدد قليل من defolliculated والبيض ناضجة في وقت واحد، على دفعات صغيرة من 5-10 البيض. إن إدماج defolliculation الأنزيمي مع هذا الإجراء يزيد من المرجح بشكل كبير العائد وسهولة الشاملة للاستخدام.
على الرغم من أن الأجنة المنتجة بعد إخصاب البويضات في المختبر -matured يمكن أن تصبح قابلة للحياة البالغين، نلاحظ أن بعد الإخصاب في المختبر، وهي جزء من الأجنة تفعل لا تقسم عادة أو في الوقت المناسب. نحن اختيار حاليا لخطوط التي تشمل جولات من بويضة في المختبر النضج، مما قد يؤدي إلى أنماط أكثر قوة للتنمية في الأجنة من خلال هذا الأسلوب نشر.
وقد سمح هذا الإجراء لإنقاذ واضحة أو تصور توطين البروتين لعدد من الطفرات 24 و 25. ومع ذلك، بالنسبة لبعض الجينات، وتنظيم التعبير المنتج قد يكون حاسما، وبالتالي فإن المنتجات التي أعرب عنها مرنا حقن قد يؤدي إلى نتائج متغيرة 26. ومن المهم أيضا أن تضع في اعتبارها جميع الضوابط (على سبيل المثال، حقن الأجنة مع الكواشف التي لها خصائص مشابهة لتلك التي استخدمت في التجربة حتى الآن ومن المتوقع أن لا تنتج أثرا، مثل المنظمات الأعضاء السيطرة أو الرنا الترميز لالبروتينات الخاملة فقط، مثل كما GFP)، والتباين الأساسي قد يؤدي إلى استنتاجات غير سليمة.
الإقليم الشمالي "> نهج تنطوي في المختبر التلاعب تليها الإخصاب مفيد بشكل خاص في حالة المنتجات المودعة للأمهات، حيث الطريقة المعيارية لحقن RNA، المنظمات الأعضاء، أو البروتين في البويضة المخصبة قد لا فعالا في الحد منتجات تراكمت بالفعل في البيض. طرق تطويرها مؤخرا الأخرى، مثل الجيل كريسبر متحولة، هي أيضا فعالة في توليد الظروف متحولة عن الجينات وأعرب أمهات (26). ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب يتطلب نمو عدة أجيال من الأسماك. وفي المختبر تقنية بويضة النضج تسمح للتلاعب وظيفي السريع ل دراسة وظيفة الجينات وأعرب أمهات، بما في ذلك الانقاذ ونسخة مظهرية الطفرات تأثير الأمهات، وكذلك التعبير عن RNA والبروتينات في الجنين في وقت مبكر.Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر أعضاء المختبر والسمك الموظفين الإداريين منشأة Pelegri، الذين كان لهم دور فعال في تسهيل هذا المشروع. وقدم الدعم لهذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة R56 GM065303 وNIH 2 T32 GM007133 إلى العلو، NIH 5 F31 GM108449-02 وNIH 2 T32 GM007133 إلى CCE، والمعاهد الوطنية للصحة RO1 GM065303 إلى FP
Materials
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| Leibovitz'z L-15 medium | Thermofisher | 11415064 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | for pH'ing |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| 17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP) | Sigma | P6285 | |
| gentamicin | Sigma | G1272 | |
| Injection Apparatus | Eppendorf | FemtoJet | or equivalent |
| Capillary Tubing for injection needles | FHC | 30-30-1 | or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm |
| Needle puller | Sutter Instruments | Model P-87 | any maker |
| Micropipetor (1-20 µl range) with tips | any maker | ||
| Micropipetor (20 – 200 µl range) with tips | any maker | ||
| Micropipetor (100 – 1000 µl range) with tips | any maker | ||
| Conical tubes 15ml | any maker | ||
| Conical tubes 50ml | any maker | ||
| plastic pipette 10 ml with bulb | any maker | ||
| plastic pipette 20 ml with bulb | any maker | ||
| Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm | AmScope | MR095 | or equivalent |
| Reagents for fish water: | |||
| Instant Ocean Salt | Drs. Foster & Smith | CD-116528 | |
| Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761-1KG | |
| Reagents for E3 medium: | |||
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| KCl | Sigma | P5405-500G | |
| CaCl2, dihydrate | Sigma | C7902-500G | |
| MgSO4, heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methylene Blue | Sigma | M9140-25G | |
| Fish Food: | |||
| Frozen brine shrimp | Brine Shrimp Direct | FBSFKG50 | |
| Tetramin Flakes | Drs. Foster & Smith | 16623 |
Riferimenti
- Lindeman, R., Pelegri, F. Vertebrate maternal-effect genes: insights into fertilization, early cleavage divisions, and germ cell determinant localization from studies in the zebrafish. Mol Rep Dev. 77 (4), 299-313 (2010).
- Abrams, E. W., Mullins, M. C. Early zebrafish development: it’s in the maternal genes. Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 396-403 (2009).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Dev Dyn. 242 (1), 44-52 (2013).
- Selman, K., Petrino, T. R., Wallace, R. A. Experimental conditions for oocyte maturation in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Exp Zool. 269 (6), 538-550 (1994).
- Fauvel, C., Omnes, M. H., Suquet, M., Normant, Y. Reliable assessment of overripening in turbot (Scophtalmus maximus) by a simple pH measurement. Aquaculture. 117 (1-2), 107-113 (1993).
- Lahnsteiner, F., Weismann, T., Patzner, R. A. Composition of the ovarian fluid in 4 salmonid speices: Onchorhynchus mykiss, Salmo trutta flacustris, Salvelinus alpinus and Husho hucho. Reprod Nutr Dev. 35 (5), 465-474 (1995).
- Patiño, R., Bolamba, D., Thomas, P., Kumakura, N. Effects of external pH on hormonally regulated ovarian follicle maturation and ovulation in Atlantic croaker. Gen Comp Endocrinol. 141 (2), 126-134 (2005).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135 (3), 285-292 (2008).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish ovarian development. Mol Cell Endocrinol. 312 (1-2), 42-52 (2009).
- Kane, D. A., Kimmel, C. B. The zebrafish midblastula transition. Development. 119 (2), 447-456 (1993).
- Kanagaraj, P., et al. Souffle/Spastizin controls secretory vesicle maturation during zebrafish oogenesis. PLoS Genet. 10 (6), e1004449 (2014).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Keeping and raising zebrafish,Zebrafish – A Practical Approach. , 7-37 (2002).
- Connoly, M. H., Dutkosky, R. M., Heah, T. P., Sayler, G. S., Henry, T. B. Temporal dynamics of oocyte growth and vitellogenin gene expression in zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 11 (2), 107-114 (2014).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Pelegri, F., Mullins, M. Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes. Meth Cell Biol. 104, 83-120 (2011).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. J Vis Exp. , (2016).
- Kimmel, C., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development in the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don’t stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Schulte-Merker, S., Stainier, D. Y. R. Out with the old, in with the new: reassessing morpholino knockdowns in light of genome editing technology. Development. 141 (16), 3103-3104 (2014).
- Dekens, M. P. S., Santoriello, C., Vallone, D., Frassi, G., Whitmore, D., Foulkes, N. S. Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr Biol. 13 (23), 2051-2057 (2003).
- Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank’s saline containing bovine serum albumin. Mol Mar Biotechnol. 6 (2), 84-87 (1997).
- Pelegri, F., Mullins, M. C. Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes. Meth Cell Biol. 135, (2016).
- Lindeman, R. E., Pelegri, F. Localized products of futile cycle/lrmp promote centrosome-nucleus attachment in the zebrafish zygote. Curr Biol. 22 (10), 843-851 (2012).
- Nair, S., Marlow, F., Abrams, E., Kapp, L., Mullins, M., Pelegri, F. The chromosomal passenger protein Birc5b organizes microfilaments and germ plasm in the zebrafish embryo. PLoS Genetics. 9 (4), e1003448 (2013).
- Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), 1585-1599 (2016).
