Méthode écotoxicologique avec des bactéries marines<em> Vibrio anguillarum</em> Évaluer la toxicité aiguë des contaminants environnementaux
Summary
Ce travail décrit un nouveau protocole pour évaluer l'écotoxicité des polluants, y compris les contaminants émergents tels que les nanomatériaux, en utilisant la bactérie marine Vibrio anguillarum . Cette méthode permet de déterminer la LC 50 , ou la mortalité, la concentration qui entraîne une diminution de 50% de la culture bactérienne, après une exposition de 6 h.
Abstract
Les bactéries sont une composante importante de l'écosystème et les altérations de la communauté microbienne peuvent avoir un impact significatif sur le cycle biogéochimique et les réseaux alimentaires. Les tests de toxicité basés sur des microorganismes sont largement utilisés car ils sont relativement rapides, reproductibles, peu coûteux et ne sont pas associés à des problèmes éthiques. Ici, nous décrivons une méthode écotoxicologique pour évaluer la réponse biologique de la bactérie marine Vibrio anguillarum. Cette méthode évalue la toxicité aiguë des composés chimiques, y compris les nouveaux contaminants tels que les nanoparticules, ainsi que des échantillons environnementaux. Le critère d'évaluation est la réduction de la culture bactérienne ( c'est-à-dire la capacité de se répliquer et de former des colonies) en raison de l'exposition à un toxique. Cette réduction peut être généralement appelée mortalité. Le test permet la détermination de la LC 50 , la concentration qui provoque une diminution de 50% des bactéries en reproduisant activement et formant des colonies, aprèsUne exposition de 6 h. Les bactéries cultivables sont comptées en termes d'unités de formation de colonies (CFU), et la «mortalité» est évaluée et comparée au témoin. Dans ce travail, la toxicité du sulfate de cuivre (CuSO 4 ) a été évaluée. Une relation dose-réponse claire a été observée, avec une LC 50 moyenne de 1,13 mg / L, après trois tests indépendants. Ce protocole, par rapport aux méthodes existantes avec des microorganismes, est applicable dans une large gamme de salinité et n'a pas de limites pour les échantillons colorés / turbides. Il utilise la solution saline comme support d'exposition, en évitant toute interférence éventuelle de milieu de croissance avec les contaminants étudiés. Le calcul LC 50 facilite les comparaisons avec d'autres bioensaiements couramment appliqués aux évaluations écotoxicologiques du milieu marin.
Introduction
Les essais biologiques écotoxicologiques évaluent la toxicité des produits chimiques ou des échantillons environnementaux avec des modèles biologiques standard, intégrant les effets des facteurs de stress physiques, chimiques et biologiques sur les écosystèmes. En raison de la complexité des écosystèmes, les évaluations des risques écotoxicologiques doivent tenir compte d'une batterie de bio-essais impliquant des organismes de différents niveaux trophiques. Les tests de toxicité sur les animaux de laboratoire peuvent être coûteux, longs et éthiquement douteux. La volonté de limiter les essais sur les animaux et de développer des approches alternatives ( par exemple, sur les bactéries et les animaux non vertébrés) est maintenant une question essentielle, telle que rapportée dans le cadre de la législation européenne actuelle, y compris la Directive européenne pour la protection des animaux, le septième amendement à la EU Cosmetics Directive, et REACH.
Les crustacés, les poissons et les algues sont largement utilisés pour des mesures de toxicité dans le milieu marin 1 . Les bactéries sont un composant importantT de l'écosystème et les modifications apportées aux communautés microbiennes peuvent avoir des effets significatifs sur le cyclisme biogéochimique et d'autres services essentiels des écosystèmes. Les tests de toxicité basés sur les microorganismes gagnent en popularité parce qu'ils sont relativement rapides, reproductibles et bon marché et ne soulèvent pas de problèmes éthiques 2 . Le but de ce travail est de décrire un protocole écotoxicologique pour évaluer la réponse de la bactérie marine Vibrio anguillarum ( Listonella anguillarum, Vibrionaceae) lorsqu'il est exposé à des contaminants environnementaux.
V. anguillarum est une bactérie Gram-négative, courte, en forme de tige (0.5 x 1.5 μm) avec un flagelle polaire. Habituellement trouvé dans l'eau saumâtre ou salée, il est halotolérant, avec une salinité optimale d'environ 20 et une température optimale entre 25 et 30 ° C 3 . Il a été choisi comme modèle d'organisme en raison de son ubiquité et de ses importants rôles écologiques en oce4 ans dans le monde entier. Certains sérotypes de V. anguillarum sont connus pour provoquer de la vibriose dans une variété d'espèces de poissons marins ou saumâtres 5 , 6 . Pour cela, certaines étapes de l'expérience nécessitent des pratiques microbiologiques standard, mais aucun équipement de sécurité ou aucune précaution particulière n'est nécessaire. Le protocole de test de toxicité proposé utilise la culture bactérienne ( c'est-à-dire la capacité de se répliquer et de former des colonies) comme point final et permet la détermination de la LC 50 , la concentration qui provoque une réduction de 50% des bactéries en reproduisant activement et en formant des colonies après Une exposition de 6 h. Dans Vibrio , comme dans d'autres microbes, cette réduction, que nous indiquons généralement comme mortalité, peut être partiellement due à des individus dans la phase 7 viable mais non cultivable (VBNC). Dans cette étude, nous avons appliqué cette méthode pour mesurer les effets toxiques du sulfate de cuivre (CuSO 4), Un toxique de référence.
Cette méthode a été développée pour fournir un test approprié, à base de microorganisme pour l'évaluation écotoxique des polluants / composés chimiques, y compris les contaminants émergents tels que les nanomatériaux. La nouveauté de ce protocole par rapport aux méthodes existantes utilisées pour les microorganismes est principalement liée au milieu d'exposition et au point final. En fait, l'exposition est effectuée dans une solution saline, en évitant toute interférence possible du milieu de croissance avec les contaminants étudiés, ce qui peut influencer la réponse biologique 8 . Le critère d'évaluation est la réduction de la culture bactérienne, qui peut être facilement comparée à d'autres paramètres aigus utilisés pour le dépistage écotoxicologique dans les milieux marins et saumâtres, en fonction de la survie / mortalité. En outre, le protocole utilise la technique des micro-comptages liquides à la plaque, déjà utilisés sur E. coli 9 , réduisant les volumes et donc l'eff expérimentalOrt (voir les étapes 3.3 et 3.4 du protocole pour plus de détails).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce travail décrit un nouvel essai biologique avec la bactérie marine V. anguillarum qui a été appliquée avec succès pour évaluer les effets toxiques du CuSO 4 , un toxique de référence, démontrant une relation dose-réponse claire. La bactérie marine V. anguillarum a été choisie comme organisme modèle car elle est halotolérante, omniprésente et représentative des écosystèmes marins.
Le test peut être effectué à une large gamme de valeurs de salinité (5-40) et peut utiliser des solutions salines et des eaux de mer synthétiques ou naturelles comme milieu d'exposition, pour autant que les microorganismes puissent survivre facilement pendant toute la durée de l'essai. Cela permet d'analyser différents types d'échantillons, y compris les environnements saumâtres et marins.
Aucun milieu de croissance n'est nécessaire pendant la phase d'exposition, en évitant son interférence avec les contaminants 8 et son influence possible sur la réponse biologique. ThLe protocole e est fiable, rapide, rentable et relativement simple. La procédure des micro-comptages liquides à la plaque 9 donne l'avantage d'utiliser de petits volumes (échantillons), bien que cela implique un haut degré de précision et de robustesse. Les résultats des trois essais et répétitions indépendants pour chaque traitement montrent la grande répétabilité de cette méthode. L'utilisation de la bactérie comme modèle biologique, ainsi que l'adaptabilité de la technique, favorisent la pertinence écologique et environnementale de cette procédure. D'autres problèmes techniques essentiels sont la précision dans la préparation de l'inoculum bactérien et la stérilité requise dans certaines étapes de la procédure.
Le test proposé est plus rapide (6 h) que les autres tests écotoxicologiques marins (24 à 96 h) et ne soulève pas les problèmes éthiques résultant de l'utilisation d'organismes supérieurs. En outre, les données sur le toxique de référence montrent des valeurs de LC 50 comparables à celles obtenues avec t aiguë Sur d'autres espèces marines 10 , 11 , démontrant une bonne sensibilité. Parmi les essais biologiques bactériens, le test d'inhibition de la luminescence V. fischeri est le plus fréquent et bien standardisé 12 . Cet essai biologique est très rapide (15 à 30 minutes) et valable pour tester des échantillons en phase solide, mais il peut être affecté par des échantillons colorés et turbides qui interfèrent avec les mesures de luminescence. La salinité est un facteur limitant dans l'utilisation de l'essai précité, avec 2% de NaCl requis 13 . Au contraire , le test proposé ici avec V. anguillarum donne des résultats abordables à une large gamme de valeurs de salinité, n'a pas de limites en ce qui concerne les échantillons turbides ou colorés et nécessite un équipement moins coûteux par rapport aux analyseurs de luminescence. Une comparaison entre les résultats de notre étude et ceux disponibles dans la littérature pour V. fisheri 14 ,Ss = "xref"> 15 , 16 montre des valeurs EC 50 comparables, ce qui confirme l'efficacité de cet essai biologique.
Cet essai biologique évalue la réduction de la culture bactérienne, généralement appelée mortalité, au lieu du taux de croissance de la population ou de l'inhibition de l'activité enzymatique, qui sont utilisés dans les tests actuellement disponibles pour les microorganismes. Le calcul LC 50 permet une comparaison avec d'autres bioensaiements couramment appliqués à l'évaluation écotoxicologique des milieux marins, qui ont souvent la survie / mortalité comme point final. Un exercice d'interétalonnage est urgent pour évaluer / confirmer la fiabilité et la reproductibilité de ce test et pour soutenir sa standardisation et son utilisation dans les protocoles réglementaires.
L'utilisation croissante des nanomatériaux et leur libération potentielle dans l'environnement impliquent la nécessité d'une évaluation des risques 17 . Cependant, clasLes approches socioéconomiques (éco) toxicologiques pour ces contaminants émergents semblent ne pas donner des résultats abordables et peuvent nécessiter des adaptations 18 . Les caractéristiques de ce nouvel essai biologique permettent leur application facile et utile à l'évaluation de la toxicité des nanoparticules. En fait, la possibilité d'effectuer le dosage à des salinités différentes donnera des comptes sur le comportement des nanoparticules sous différentes forces ioniques, une variable de paramètre environnemental qui peut affecter de manière significative la toxicité 19 . En outre, aucune évaluation de l'écotoxicité des nanoparticules n'est recommandée dans le cas des nanoparticules, car les substances organiques peuvent faciliter leur absorption en augmentant les effets toxiques 20 ou peuvent provoquer une agrégation, en réduisant la fraction biodisponible et donc leur toxicité 21 .
En conclusion, l'essai biologique sur Vibrio anguillarum est apPour l'évaluation des risques des contaminants classiques et émergents, ainsi que pour l'évaluation du statut des milieux marins et saumâtres.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par le projet de recherche: "NanoBioTech ambiente e salute. Progetto 2: Ambiente. Strumenti e metodi per il surveaggio ecotossicologico delle Nanoparticelle" ( "Nano-BioTechnology: environnement et santé. Projet 2: Environnement. Outils et méthodes pour l'écotoxicologie Suivi des nanoparticules " ) accordé à LM de Regione Lazio-Consorzio Hypatia. AR a été financé par une subvention postdoctorale de l'Université de Tor Vergata / Regione Lazio-Consorzio Hypatia dans le cadre du projet précédemment cité. Un accord avec l'Université ISPRA-Tor Vergata (N. 2015/52857) a permis l'utilisation mutuelle des installations et des échanges de chercheurs.
Les auteurs sont redevables à la Professeure Maria Cristina Thaller, notre ange gardienne pour toutes les activités microbiennes, pour susciter l'intérêt pour le monde microbien et pour aider à améliorer nos recherches sur le sujet. Les auteurs remercient Andrea Tornambè et EriKa Magaletti pour la collaboration précieuse avec le laboratoire ISPRA de l'écologie et de l'écotoxicologie du phytoplancton.
Materials
| Vibrio anguillarum (strain AL 102, serotype O1) | Obtained from the laboratory collection of NOIFMA (Norway) | ||
| Tryptic Soy Agar | Liofilchem | 610052 | Dehydrated Culture Media |
| Tryptic Soy Broth growth medium | Liofilchem | 610053 | Dehydrated Culture Media |
| CuSO4 ·5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar Flow Hood | ESCO | ||
| Incubator | Fratelli Galli | Mod. 2100 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Benchmark Dose Software | US EPA | Benchmark Dose 2.4.0 | 2012 |
Riferimenti
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