Ecotoxicologische methode met mariene bacteriën<em> Vibrio anguillarum</em> De acute toxiciteit van milieuverontreinigende stoffen beoordelen
Summary
Dit werk beschrijft een nieuw protocol voor de beoordeling van de ecotoxiciteit van verontreinigende stoffen, waaronder opkomende verontreinigingen zoals nanomaterialen, met behulp van de mariene bacterie Vibrio anguillarum . Deze methode laat de bepaling van de LC 50 of sterfte toe, de concentratie die een kweekbaarheid van 50% van de bacteriën veroorzaakt, na een 6 uur blootstelling.
Abstract
Bacteriën zijn een belangrijk onderdeel van het ecosysteem, en veranderingen in microbiële gemeenschappen kunnen een significant effect hebben op biogeochemische cycli en voedingswebs. Toxiciteitstesten op basis van micro-organismen worden veel gebruikt omdat ze relatief snel, reproduceerbaar, goedkoop zijn en niet geassocieerd worden met ethische problemen. Hier beschrijven we een ecotoxicologische methode om de biologische reactie van de mariene bacterie Vibrio anguillarum te evalueren. Deze methode beoordeelt de acute toxiciteit van chemische verbindingen, waaronder nieuwe verontreinigingen zoals nanodeeltjes, evenals milieuproeven. Het eindpunt is de vermindering van de bacteriële culturaliteit ( dwz de mogelijkheid om kolonies te repliceren en te vormen) door blootstelling aan een toxicant. Deze reductie kan over het algemeen worden aangeduid als sterfte. De test staat voor de bepaling van de LC 50 , de concentratie die een 50% daling van bacteriën veroorzaakt die actief repliceren en colonies vormt, naEen 6 uur blootstelling. De culturele bacteriën worden geteld in kolonievormende eenheden (CFU), en de "sterfte" wordt geëvalueerd en vergeleken met de controle. In dit werk werd de toxiciteit van kopersulfaat (CuSO 4 ) geëvalueerd. Een duidelijke dosis-respons verhouding werd waargenomen, met een gemiddelde LC 50 van 1,13 mg / L, na drie onafhankelijke tests. Dit protocol, in vergelijking met bestaande methoden met micro-organismen, is van toepassing in een breder waaier van zoutgehalte en heeft geen beperkingen voor gekleurde / troebele monsters. Het gebruikt zoutoplossing als het blootstellingsmedium, waardoor eventuele interferenties van groeimedium worden vermeden met de onderzochte verontreinigingen. De berekening van LC 50 vergemakkelijkt vergelijkingen met andere bioassays die gewoonlijk worden toegepast op ecotoxicologische beoordelingen van het mariene milieu.
Introduction
Ecotoxicologische bioassays evalueren de toxiciteit van chemicaliën of milieuproeven met standaard biologische modellen, waarbij de effecten van fysische, chemische en biologische stressoren op ecosystemen worden geïntegreerd. Vanwege de complexiteit van ecosystemen moeten ecotoxicologische risicobeoordelingen een batterij bioassays overwegen die organismen uit verschillende trofische niveaus betreffen. Toxiciteitsbepalingen op laboratoriumdieren kunnen duur zijn, tijdrovend en ethisch twijfelachtig zijn. De rijding om dierproeven te beperken en alternatieve benaderingen te ontwikkelen ( bijv. Bij bacteriën en niet-gewervelde dieren) is nu een cruciale kwestie, zoals gerapporteerd in het kader van de huidige Europese wetgeving, inclusief de EU-richtlijn inzake dierenbescherming, de 7e wijziging van de EU Cosmetics Directive, en REACH.
Schaaldieren, vis en algen worden grotendeels gebruikt voor toxiciteitsmetingen in het mariene milieu 1 . Bacteriën zijn een belangrijke componenT van het ecosysteem, en veranderingen in microbiële gemeenschappen kunnen aanzienlijke effecten hebben op biogeochemische cycli en andere kritische ecosysteemdiensten. Toxiciteitstesten op basis van micro-organismen worden populairder omdat ze relatief snel, reproduceerbaar en goedkoop zijn en geen ethische problemen opleveren 2 . Het doel van dit werk is om een ecotoxicologisch protocol te beschrijven om de respons van de mariene bacterie Vibrio anguillarum ( Listonella anguillarum, Vibrionaceae) te beoordelen wanneer deze blootgesteld worden aan milieuverontreinigende stoffen.
V. anguillarum is een gram- negatieve , korte, kromme-vormige staafbacterie (0,5 x 1,5 μm) met een polaire flagellum. Typisch gevonden in brak of zout water, het is halotolerant, met een optimale zoutgehalte van ongeveer 20 en een optimale temperatuur tussen 25 en 30 ° C 3 . Het is gekozen als een organisme model vanwege zijn ubiquity en zijn belangrijke ecologische rollen in oceWereldwijd 4 . Sommige serotypes van V. anguillarum zijn bekend dat ze vibriose veroorzaken in een verscheidenheid aan mariene of brakvis vissen 5 , 6 . Hiervoor vereisen enkele stappen van het experiment standaard microbiologische praktijken, maar er zijn geen speciale veiligheidsvoorzieningen of voorzorgsmaatregelen nodig. Het voorgestelde toxiciteitscontroleprotocol maakt gebruik van de bacteriële culturaliteit ( dwz de mogelijkheid om kolonies te repliceren en te vormen) als het eindpunt en maakt het mogelijk de bepaling van de LC 50 te bepalen , de concentratie die een 50% reductie van bacteriën veroorzaakt die actief repliceren en colonies vormt, na Een blootstelling van 6 uur. In Vibrio , zoals bij andere microben, kan deze reductie, die we meestal als sterfte wijzen, gedeeltelijk te wijten zijn aan personen in de levensvatbare maar niet-cultureel (VBNC) fase 7 . In deze studie hebben we deze methode toegepast om de giftige effecten van kopersulfaat (CuSO 4) te meten), Een referentietoxicum.
Deze methode is ontwikkeld om een geschikte test op basis van micro-organismen te leveren voor de ecotoxische beoordeling van verontreinigende stoffen / chemische verbindingen, waaronder opkomende verontreinigingen zoals nanomaterialen. De nieuwigheid van dit protocol in vergelijking met bestaande methoden die voor micro-organismen worden gebruikt, is hoofdzakelijk gerelateerd aan het blootstellingsmedium en het eindpunt. In feite wordt de blootstelling uitgevoerd in zoutoplossing, waarbij eventuele interferentie van het groeimedium wordt vermeden met de onderzochte verontreinigingen, die de biologische respons kunnen beïnvloeden 8 . Het eindpunt is de vermindering van de bacteriële culturaliteit, die gemakkelijk kan worden vergeleken met andere acute eindpunten die worden gebruikt voor ecotoxicologische screening in mariene / brackende omgevingen, gebaseerd op overleving / sterfte. Bovendien gebruikt het protocol de techniek van micro-cijfers van vloeistof tot plaat, die al op E. coli 9 is gebruikt , waardoor volumes worden verminderd en dus de experimentele effekOrt (zie stappen 3.3 en 3.4 van het protocol voor details).
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit werk beschrijft een nieuwe bioassay met de mariene bacterie V. anguillarum die succesvol is toegepast om de toxische effecten van CuSO 4 , een referentietoxicum, te beoordelen, waarbij een duidelijke dosis-respons relatie wordt aangetoond. De mariene bacterie V. anguillarum werd gekozen als model organisme omdat het halotolerant, alomtegenwoordig en representatief is voor mariene ecosystemen.
De test kan worden uitgevoerd op een breed scala aan zoutwaarden (5-40) en kunnen zoutoplossingen en synthetische of natuurlijke zeewater gebruiken als blootstellingsmedium, zolang micro-organismen gemakkelijk kunnen overleven gedurende de gehele test. Dit zorgt voor de analyse van verschillende soorten monsters, waaronder brak- en mariene omgevingen.
Tijdens de blootstellingsfase is geen groeimedium vereist, waardoor de interferentie met de verontreinigende stoffen 8 en de mogelijke invloed op de biologische reactie wordt vermeden. thE protocol is betrouwbaar, snel, kosteneffectief en relatief eenvoudig. De procedure van vloeistof-aan-plaat micro-cijfers 9 geeft het voordeel van het gebruik van kleine (monster) volumes, hoewel dit impliceert een hoge mate van nauwkeurigheid en robuustheid. De resultaten van de drie onafhankelijke proeven en replicaten voor elke behandeling tonen de hoge herhaalbaarheid van deze methode. Het gebruik van bacteriën als biologisch model, evenals de aanpasbaarheid van de techniek, bevordert de ecologische en milieu-relevantie van deze procedure. Andere kritische technische problemen zijn nauwkeurigheid bij de bereiding van het bacterie-inoculum en de steriliteit die nodig is in sommige stappen van de procedure.
De voorgestelde test is sneller (6 uur) dan andere mariene ecotoxicologische analyses (24-96 uur) en verhoogt de ethische problemen die voortvloeien uit het gebruik van hogere organismen. Bovendien tonen de gegevens over het referentietoxicaat LC 50 waarden die vergelijkbaar zijn met die verkregen bij acute t Ests op andere mariene soorten 10 , 11 , die een goede gevoeligheid aantonen. Bij bacteriële bioassays is de V. fischeri luminescentie remmingstest de meest voorkomende en goed gestandaardiseerde 12 . Deze bioassay is zeer snel (15-30 minuten) en geldig voor het testen van vaste-fase monsters, maar kan beïnvloed worden door gekleurde en troebele monsters, die interfereren met luminescentiemetingen. Zoutgehalte is een beperkende factor bij het gebruik van de bovengenoemde test, met 2% NaCl vereist 13 . Integendeel , de hier voorgestelde test met V. anguillarum geeft betaalbare resultaten bij een breed scala aan zoutgehalte, heeft geen beperkingen in verband met troebele of gekleurde monsters en vereist minder duur materiaal in vergelijking met de luminescentieanalysatoren. Een vergelijking tussen de resultaten van onze studie en de beschikbare literatuur voor V. fisheri 14 ,Ss = "xref"> 15 , 16 toont vergelijkbare EC 50 waarden, die de effectiviteit van deze bioassay verder ondersteunen.
Deze bioassay beoordeelt de vermindering van de bacteriële culturaliteit, in het algemeen aangeduid als sterfte, in plaats van populatiegroei of enzymatische activiteit remming, die gebruikt worden in de momenteel beschikbare tests voor micro-organismen. De LC 50 berekening maakt het mogelijk om te vergelijken met andere bioassays die vaak toegepast worden op de ecotoxicologische beoordeling van mariene omgevingen, die vaak overleving / sterfte hebben als het eindpunt. Een interkalibratie oefening is dringend nodig om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van deze test te beoordelen / te bevestigen en de standaardisatie en het gebruik ervan in regulerende protocollen te ondersteunen.
Het toenemende gebruik van nanomaterialen en hun potentiële vrijlating in het milieu impliceert de noodzaak van risicobeoordeling 17 . Echter, clasToxicologische aanpakken voor deze opkomende verontreinigingen lijken geen betaalbare resultaten te geven en kunnen aanpassingen vereisen 18 . De kenmerken van deze nieuwe bioassay maken het gemakkelijk en handig voor de toxiciteitsbeoordeling van nanodeeltjes mogelijk. In feite kan de mogelijkheid om de test op verschillende salinen uit te voeren, nanodeeltjesgedrag geven onder verschillende ionische sterkten, een omgevingsparametervariabele die de toxiciteit significant kan beïnvloeden 19 . Bovendien wordt geen gebruik van groeimedium en voedingsstoffen aanbevolen bij de ecotoxiciteitsbeoordelingen van nanodeeltjes, omdat organische stoffen hun absorptie kunnen vergemakkelijken door de toxische effecten 20 te verhogen of aggregatie kunnen veroorzaken, waardoor de biologische beschikbaarheid en dus hun toxiciteit 21 kunnen worden verminderd.
Ten slotte is de bioassay op Vibrio anguillarum apRomiseringsinstrument voor de risicobeoordeling van klassieke en opkomende verontreinigingen, evenals voor de beoordeling van de status van mariene en brakige omgevingen.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk is gefinancierd door het onderzoeksproject: "NanoBioTech ambiente e salute. Progetto 2: Ambiente. Strumenti e metodi per monitoraggio ecotossicologico delle Nanoparticelle" ( "Nano-BioTechnology: milieu en gezondheid." Project 2: Milieu. Hulpmiddelen en methoden voor ecotoxicologische Monitoring van nanodeeltjes " ) toegekend aan LM van Regione Lazio-Consorzio Hypatia. AR werd gefinancierd door een postdoctorale subsidie van de Universiteit van Tor Vergata / Regione Lazio-Consorzio Hypatia in het kader van het eerder aangehaalde project. Een akkoord met de ISPRA-Tor Vergata University (N. 2015/52857) liet het onderlinge gebruik van faciliteiten en de uitwisseling van onderzoekers toe.
De auteurs zijn verschuldigd aan prof. Maria Cristina Thaller, onze beschermengel voor alle microbiële activiteiten, om belangstelling in de microbiële wereld te verhogen en sterk te helpen bij het verbeteren van ons onderzoek op dit gebied. De auteurs erkennen dankbaar Andrea Tornambè en EriKa Magaletti voor de kostbare samenwerking met het ISPRA Lab of Phytoplankton ecology en ecotoxicology.
Materials
| Vibrio anguillarum (strain AL 102, serotype O1) | Obtained from the laboratory collection of NOIFMA (Norway) | ||
| Tryptic Soy Agar | Liofilchem | 610052 | Dehydrated Culture Media |
| Tryptic Soy Broth growth medium | Liofilchem | 610053 | Dehydrated Culture Media |
| CuSO4 ·5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar Flow Hood | ESCO | ||
| Incubator | Fratelli Galli | Mod. 2100 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Benchmark Dose Software | US EPA | Benchmark Dose 2.4.0 | 2012 |
Riferimenti
- Parvez, S., Venkataraman, C., Mukherji, S. A review on advantages of implementing luminescence inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of chemicals. Environm. Internat. 32 (2), 256-268 (2006).
- Rad, M., Shahsavani, D. Isolation and characterization of Vibrio (Listonella) anguillarum from catfish. Turkish J. Veter. Animal. 34 (4), 413-415 (2010).
- Thompson, F., Iida, T., Swings, J. Biodiversity of Vibrios. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, 403-431 (2004).
- Austin, B., Austin, D. A. Vibrionaceae representatives: characteristics of the disease. Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish. 29-30, 108-115 (1999).
- Larsen, J. L., Mellergaard, S. Microbiological and hygienic problems in marine aquaculture: furunculosis and vibriosis in rainbow trout (Salmo gairdneri). L.). Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 1, 29-31 (1981).
- Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. J. Microbiol. 43 (1), 93-100 (2005).
- Hsieh, C. -. Y., Tsai, M. -. H., Ryan, D. K., Pancorbo, O. C. Toxicity of the 13 priority pollutant metals to Vibrio fisheri in the Microtox chronic toxicity test. Sci. Total Environ. 320, 37-50 (2004).
- Migliore, L., Rotini, A., Thaller, M. C. Low doses of Tetracycline trigger the E. coli growth: a case of hormetic response. Dose-Response. 11, 550-557 (2013).
- Adams, M. S., Stauber, J. L. Development of a whole-sediment toxicity test using a benthic marine microalga. Environm. Toxicol. Chem. 23 (8), 1957-1968 (2004).
- Manfra, L., et al. Ecotoxicity of diEthylene Glycol and risk assessment for marine environment. J. Hazard. Mat. 284, 130-135 (2015).
- . . Microtox® Acute Toxicity Solid-Phase Test. , 20 (1995).
- . Metodi analitici per le acque. Manuali e Linee Guida (Analytical methods for waters. Manual and Guidelines). Metodi Ecotossicologici (Ecotoxicological methods). 29 (3), 8030 (2003).
- Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. -. C., Kahru, A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus. Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).
- Mortimer, M., Kasemets, K., Heinlaan, M., Kurvet, I., Kahru, A. High throughput kinetic Vibrio fischeri bioluminescence inhibition assay for study of toxic effects of nanoparticles. Toxicol. In Vitro. 22 (5), 1412-1417 (2008).
- Bondarenko, O. M., et al. Multilaboratory evaluation of 15 bioassays for (eco) toxicity screening and hazard ranking of engineered nanomaterials: FP7 project NANOVALID. Nanotoxicology. 10 (9), 1229-1242 (2016).
- Matranga, V., Corsi, I. Toxic effects of engineered nanoparticles in the marine environment: model organisms and molecular approaches. Mar. Envir. Res. 76, 32-40 (2012).
- Corsi, I., et al. Common strategies and technologies for the ecosafety assessment and design of nanomaterials entering the marine environment. ACS NANO. 8 (10), 9694-9709 (2014).
- Handy, R. D., von der Kammer, F., Lead, J. R., Hassellöv, M., Owen, R., Crane, M. The ecotoxicology and chemistry of manufactured nanoparticles. Ecotoxicology. 17, 287-314 (2008).
- Kasemets, K., Suppi, S., Kunnis-Beres, K., Kahru, A. Toxicity of CuO nanoparticles to yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 wild-type and its nine isogenic single-gene deletion mutants. Chem. Res. Toxicol. 26, 356-367 (2013).
- Ivask, A., et al. Mechanisms of toxic action of Ag, ZnO and CuO nanoparticles to selected ecotoxicological test organisms and mammalian cells in vitro: A comparative review. Nanotoxicology. 8 (1), 57-71 (2013).
